Illumina MiSeq高通量测序分析向日葵根内细菌多样性

【作者】 马军； 黄绪堂； 王广金； 孙为民； 王文军； 梁春波； 张明； 孙涛； 王静；

【机构】 黑龙江省农业科学院博士后科研工作站； 黑龙江省向日葵遗传改良工程技术研究中心； 黑龙江省农业科学院经济作物研究所； 黑龙江省农业科学院大豆研究所； 甘南县向日葵研究所；

【摘要】 为了调查向日葵根内生细菌群落多样性,本研究以多枝型向日葵的根为研究对象,应用Illumina MiSeq高通量测序技术测定根内生细菌。提取向日葵根基因组DNA后,采用16S rDNA V5-V7区引物799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）和1193R（5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′）对目的片段进行PCR扩增,PCR采用TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase;每个样本3个重复,将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测,使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物,Tris-HCl洗脱;2%琼脂糖电泳检测。PCR反应体系为:10×Pyrobest Buffer 5μL,dNTPs（2.5mmol/L）4μL,正、反向引物（10μmol/L）各2μL,Pyrobest DNA Polymerase（2.5U/μL,TaKaRa Code:DR005A）0.3μL,模板DNA 3μL（30ng）,补充ddH₂O 33.7μL,总计50μL。PCR反应条件为95℃C 5min;95℃30s,56℃30s,72℃40s（25个循环）;4℃保温。电泳时间30min,电压150V。将PCR产物用QuantiFluorTMST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量,之后按照每个样本的测序量要求,进行相应比例的混合,进行构建Miseq文库与Miseq测序,最后使用Uparse等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元（OTU）数量,分析向日葵根内生细菌物种组成和丰度。物种多样性分析显示,3个样本的OTU数量为259～345,OTU总数425。稀释曲线表明测序深度充分,OTU数量接近于饱和。向日葵根样品的Chao1指数331.862,Shannon多样性指数5.008。共检测到13个菌门,其中优势菌门是Actinobacteria（51.14%）、Proteobacteria（31.24%）、Bacteroidetes（11.14%）;共检测到113个菌属,优势菌属中主要有链霉菌属Streptomyces（41.54%）、Unidentified（23.46%）、iastella（8.81%）、Uncultured（4.19%）和Amycolatopsis（3.08%）等。这项工作为人们深入研究向日葵内生微生物资源的种类和功能提供理论依据。更多还原