油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位、原核表达及其酶活性分析

【作者】 胡茂龙； 龙卫华； 高建芹； 陈锋； 周晓婴； 张维； 陈松； 张洁夫； 浦惠明；

【机构】 江苏省农业科学院经济作物研究所农业部长江下游棉花与油菜重点实验室国家油料作物改良中心南京分中心；

【摘要】 为了研究油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位与酶学特性,以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）品系N131为材料,采用RT-PCR法克隆到BnALS3的cDNA序列。该序列含有一个长度为1 959bp的开放阅读框,编码蛋白为652个氨基酸,N端含有一个由49个氨基酸残基组成的叶绿体信号肽序列。将该信号肽序列构建至植物表达载体35S::BnALS3-GFP中,利用拟南芥原生质体细胞进行瞬时表达,结果显示BnALS3蛋白定位在叶绿体中。构建去除叶绿体信号肽序列的BnALS3原核表达载体pCzn1-BnALS3,转入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达。SDS-PAGE和Western Blot检测显示,在11℃条件下以终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导8h后,BnALS3基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白His-BnALS3呈部分可溶性,分子量约为67kD。酶活分析表明,原核表达的His-BnALS3最适反应pH值为7.0,最佳反应温度为37℃,酶学常数K_m值和V_max值分别为6.55mmol·L^-1和6.40μmol·mg^-1·h^-1。更多还原