利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术创建抗菌核病甘蓝型油菜新种质

【作者】 吴健； 王幼平；

【机构】 扬州大学生物科学与技术学院；

【摘要】 基因组编辑技术是指可以在基因组水平上对DNA序列进行定点改造的遗传操作技术,其在基因功能研究和作物遗传改良等方面都具有重大的应用价值。CRISPR（clustered,regularly interspaced,palindromic repeat）/Cas9（CRISPR-associated 9）系统是目前最简便和最常用的基因组定点编辑系统之一。利用CRISPR/Cas9系统在植物中已经成功实现了单基因突变或多重突变。为了利用该技术创建抗菌核病甘蓝型油菜新种质,我们首先挑选了在接种核盘菌后差异表达的两个WRKY基因（BnWRKY11和BnWRKY70）进行尝试,其中BnWRKY11的多个拷贝受核盘菌诱导显著上调表达,而BnWRKY70的多个拷贝在接种核盘菌后显著下调表达。此外,在拟南芥中AtWRKY11和AtWRKY70参与了JA和SA信号途径介导的抗病反应。在甘蓝型油菜中利用CRISPR/Cas9系统分别对2个拷贝的BnWRKy11和4个拷贝的BnWRKY70进行敲除,每个基因分别设计了3个靶位点。共得到22株BnWRKY11和8株BnWRKY70的T₀敲除系,突变效率分别为54.5%（12/22）和50%（4/8）。在这些突变事件中,84.21%是插入突变,15.79%是删除突变,没有检测到碱基替代突变,而且多数突变为单碱基突变（27/38）。在T₀共获得了同时敲除2个拷贝的BnWRY11系8株,同时敲除2个拷贝的BnWRY70系2株。对T₁进行突变分析发现出现了新的突变事件,BnWRY70有些株系同时敲除了3个拷贝。随后我们对T₁4个BnWRKY70敲除系和2个BnWRKY11敲除系进行核盘菌接种试验,发现与转基因受体对照相比,BnWRKY70敲除植株对菌核病的抗性显著增强,而BnWRKY11敲除植株抗性变化不明显。此外,过表达BnWRKY70植株对菌核病抗性显著减弱。上述研究表明BnWRKY70可能负调控甘蓝型油菜对菌核病的抗性反应,CRISPR/Cas9基因组编辑技术可以用于创建抗菌核病甘蓝型油菜新种质。更多还原