miR-4297对卵巢癌细胞自噬的调控作用及其机制研究

【作者】 徐盼； 王红静； 易韬； 杨凌云； 陈静；

【机构】 四川大学华西第二医院；

【摘要】 目的:卵巢癌是妇科恶性肿瘤死亡率最高的疾病,目前手术辅以化疗的方法虽然在临床上取得了一定的疗效,但是其易于转移、复发和化疗耐药等问题导致预后较差。近年来许多研究表明,微小RNA(microRNA,miRNA)能够通过抑制肿瘤细胞的保护性自噬而促进其凋亡,有望成为肿瘤基因治疗的新靶点。我们在前期研究中通过基因芯片技术发现,miR-4297在自噬诱导后的卵巢癌细胞A2780中显著性低表达,提示miR-4297可能与卵巢癌细胞自噬密切相关,本实验将进一步探索miR-4297对卵巢癌细胞自噬的调控作用及其机制,寻找卵巢癌基因治疗的潜在靶点。方法:采用饥饿法诱导卵巢癌细胞A2780和OVCAR3发生自噬,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测miR-4297在卵巢癌细胞中的表达水平;通过TargetScan、miRanda和miRDB等生物信息学方法预测miR-4297的自噬相关靶基因;采用脂质体法分别转染miR-4297合成物(激动剂mimic、抑制剂inhibitor)或空白对照至细胞A2780中,并用饥饿法诱导细胞自噬,通过荧光显微镜观察自噬小体(GFP-LC3)形成、Western blot法检测自噬相关蛋白LC3的表达等方法分析miR-4297对卵巢癌细胞自噬活性的影响,RT-PCR法检测靶基因WIPI1 mRNA的表达以分析miR-4297对WIPI1的调控作用。结果:(1)qRT-PCR结果显示,自噬诱导后的卵巢癌细胞A2780和OVCAR3中miR-4297表达明显低于未诱导自噬组,分别下降5.35和3.45倍(p<0.05)。(2)EBSS培养基饥饿处理A2780细胞后,细胞的自噬活性在饥饿2h内随时间逐渐增强,2h后则逐渐减弱。(3)转染miR-4297 mimic、inhibitor或空白对照至A2780细胞并诱导自噬后,对照组的自噬阳性细胞比例约为61%,mimic组的自噬阳性细胞比例下降至37%(p<0.05),而inhibitor组与对照组比较无明显差异(p>0.05)。(4)转染并诱导细胞自噬后,将对照组的LC3II/LC3I比值标准化为1,mimic组的LC3II/LC3I比值下降为0.60(p<0.05),加用巴伐洛霉素处理后LC3II/LC3I比值下降为0.62(p<0.05),而inhibitor组均无明显差异(p>0.05)。(5)转染并诱导细胞自噬后,mimic组WIPI1 mRNA的表达显著下降(p<0.05),而inhibitor组无明显差异(p>0.05)。结论:miR-4297在自噬诱导后的卵巢癌细胞A2780和OVCAR3中差异性低表达,上调miR-4297可明显减弱A2780细胞的自噬活性,miR-4297可能通过下调自噬相关基因WIPI1的表达而抑制卵巢癌细胞的自噬。miR-4297对卵巢癌细胞保护性自噬的抑制作用,使其可能成为卵巢癌基因治疗的新靶点。更多还原