RNAi沉默CCR2基因对人高转移性前列腺癌细胞株PC-3M增殖、凋亡、迁移和侵袭作用的影响

【作者】 高吉； 王凯臣； 王伟华；

【机构】 吉林大学中日联谊医院；

【摘要】 研究背景:前列腺癌(prostate cancer,PCa)是一种男性中常见的恶性肿瘤,多发生于老年男性中。前列腺癌已经成为西方国家的癌症相关死亡的第二大原因,不仅如此,在中国,前列腺癌的发病率趋势在增加。在美国最近的几年内,前列腺癌新增241740人,死亡人数为28170。前列腺癌死亡的主要原因为癌转移产生的并发症。早期或局部前列腺癌,通过根治性前列腺切除术得到有效的治愈,患者的5年生存率超过99%。然而,晚期转移性前列腺癌患者的预后不佳,这些患者的5年生存率只有约31%。在很大程度上,缺乏有效的治疗晚期前列腺癌手段与前列腺癌更深入的分子机制缺乏了解有关。因此,寻找抑制前列腺癌生长和转移的重要分子机制和相关靶点,是治疗晚期前列腺癌亟待解决的问题。趋化因子,通过与其受体结合,在细胞迁移过程中发挥主要作用。此外,最近研究发现,趋化因子参与肿瘤细胞生物学的各个方面,包括调节细胞增殖、细胞凋亡、血管生成、转移与肿瘤免疫。大量的研究显示在CC趋化因子超家族的成员中,CC趋化因子配体2(Chemokine(C-C)motif ligand 2,CCL2),也被称为单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1),与肿瘤的发展和转移密切相关。在急性炎症和血管生成中,它在招募和活化单核细胞中发挥了基础性作用。肿瘤细胞和多种细胞能够表达CCL2,包括基质细胞、白细胞、和内皮细胞。大量研究表明CCL2的高表达也与许多肿瘤的发展、浸润和转移相关,尤其是在前列腺癌,CCL2可能是防治癌症的重要靶点。趋化因子与趋化因子受体(chemokine receptor)结合后可参与多种生理和病理过程,趋化因子受体是一类表达于不同类型细胞上的能与趋化因子结合的含有七个跨膜区的G蛋白耦联受体。我们团队之前的研究数据也证实了CCL2在推动PC-3M的生长和侵袭中发挥着重要作用,在PC-3M细胞中,特异性干涉CCL2表达能够抑制PC-3M细胞生长和侵袭并且增加PC-3M细胞凋亡。而CCL2介导前列腺癌生长和转移是否特异性通过其受体CCR2(C-C chemokine receptor type 2)目前报道甚少。目的:鉴于本团队的前期工作基础,本实验通过构建能够特异性干扰CCR2基因的重组质粒,观察si RNA介导的干涉CCR2后是否也影响了PC-3M细胞的生长、凋亡、迁移和侵袭。以进一步证实CCR2在前列腺癌生长和转移中的作用。方法:我们基于RNAi的技术,在NCBI上根据CCR2 m RNA序列选择合适的靶位点,构建在真核细胞中能表达出sh RNA-CCR2,进而被Dicer酶切割成si RNA-CCR2的3个重组质粒p GCSi-CCR2。采用RT-PCR的方法筛选含有最佳干扰作用靶序列的重组质粒。采用免疫荧光显微镜观察重组质粒p GCSi-CCR2的转染效率;采用RT-PCR和Western blot检测转染重组质粒p GCSi-CCR2的干涉效率。采用MTT实验检测转染重组质粒p GCSi-CCR2后PC-3M的增殖情况;采用TUNEL实验检测转染重组质粒p GCSi-CCR2后PC-3M的凋亡情况。采用RT-PCR和Western blot分别检测细胞增殖、凋亡相关基因c-Myc、cyclin D、Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达情况。采用划痕实验检测转染重组质粒p GCSi-CCR2后PC-3M的迁移情况。采用Transwell实验检测转染重组质粒p GCSi-CCR2后PC-3M的侵袭情况。采用RT-PCR和Western blot分别检测参与肿瘤转移基因MMP 2和MMP 9的表达情况。结果:RT-PCR和Western blot检测的结果显示,转染质粒p GCSi-CCR2能够有效抑制PC-3M中CCR2的表达。MTT和TUNEL实验证明,PC-3M转染质粒pG CSi-CCR2后细胞增殖的速度明显变慢,并且细胞的凋亡率显著增加。根据试验设计,划痕实验和Transwell实验表明干涉CCR2也减少了PC-3M细胞的迁移和侵袭。机制研究发现,干涉CCR2表达调控了一些参与肿瘤的生长和转移的分子,包括c-Myc、cyclin D、Bcl-2、Bax、Caspase-3、MMP 2和MMP 9基因。结论:特异性干涉CCR2表达能够抑制高转移性前列腺癌细胞株PC-3M细胞的增殖迁移和侵袭,并且能够诱导PC-3M细胞凋亡。特异性干涉CCR2表达对PC-3M细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭的调控作用与其能够调控一些列与增殖、凋亡和转移的基因有关,包括c-Myc、cyclin D、Bcl-2、Bax、Caspase-3、MMP 2和MMP 9基因。更多还原