表达DsRed和NanoLuc双报告基因的重组伪狂犬病病毒的构建与鉴定

【作者】 吴红霞； 向广韬； 周末； 孙元； 仇华吉；

【机构】 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；

【摘要】 CRISPR/Cas9是几年前出现的一种由小的引导RNA(single guide RNA,sgRNA)介导的Cas9核酸酶对靶基因进行特异性切割的基因编辑技术,该技术被广泛应用于重组DNA病毒(如疱疹病毒和慢病毒)的构建及抗病毒研究。为了快速评价sgRNA对伪狂犬病病毒(PRV)特定基因的切割效率,本研究以PRV TJ株US9和US2基因之间的间隔序列为插入位点,将DsRed和NanoLuc荧光素酶融合基因表达框插入该位点,构建供体质粒,然后通过同源重组获得重组病毒rPRV-Red-Na noLuc。研究证实,用rPRV-Red-NanoLuc感染PK-15细胞后,在荧光显微镜下可观察到红色荧光蛋白的表达:在细胞裂解液中加入Furimazine底物时,检测到NanoLuc荧光强度约为108 photons/s;重组病毒的生长曲线与亲本病毒株PRV TJ株的相似;插入的DsRed和NanoLuc报告基因在连续传代10代后稳定表达;rPRV-Red-NanoLuc感染细胞后检测到荧光强度与病毒感染剂量及持续时间呈正相关;靶向PRV TJ株基因组UL9、UL30和UL5等基因的sgRNA转染组荧光强度与对照相比明显降低,表明重组病毒复制水平显著下降。综上所述,所构建的重组病毒rPRV-Red-NanoLuc能够用于评价靶向PRV TJ基因组的sgRNA的剪切效率。更多还原