微小嗜血支原体血清抗体间接ELIA检测方法的建立

【作者】 付媛； 石团员； 杨富文； 王跃飞；

【机构】 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所； 浙江省东阳市良种场；

【摘要】 目的:嗜血支原体(Haemotrophic Mycoplasma,又称附红细胞体)是一类感染多种哺乳动物红细胞的支原体,感染宿主发生溶血性贫血。微小嗜血支原体(Mycoplasma parvum M.parvum)是猪源嗜血支原体的一种,该病原可致猪传染性贫血,从而影响母猪生产性能。由于不能体外培养且致死率不高,国内外对M.parvum的研究报道较少。我们近期开展的PCR病原流行病学调查结果显示,M.parvum在我国浙江省广泛流行,且和其他猪源嗜血支原体Mycoplasma suis(M.suis)和Candidate Mycoplasma haemosuis(CMh)存在混合感染的情况,鉴于此本研究拟建立微小嗜血支原体(Mycoplasma parvum)血清抗体间接ELISA检测方法,在抗体水平上为猪源嗜血支原体流行病学的深入调查奠定基础。方法:本研究以原核表达截短的M.parvum甘油醛脱氢酶(GAPDH)mpt GAPDH重组蛋白为包被抗原,通过对ELISA抗原包被浓度、最佳封闭液和封闭时间、血清最佳稀释度和作用时间、酶标二抗最佳稀释度和作用时间等一系列条件的优化,建立检测M.parvum血清抗体的间接ELISA诊断方法。结果:确定了M.parvum的间接ELISA最佳抗原包被浓度为3.5μg/m L;最佳封闭条件为用5%脱脂乳37℃温箱内封闭1.5h;血清最适稀释度为1:160,作用时间为1h;酶标二抗最适稀释度为1∶12500,最适作用时间为1h;最后TMB显色液37℃显色5min,50μL 0.5M H2SO4终止反应。判定标准为OD450≥0.357时判为阳性,OD450<0.304时判为阴性,0.304≤OD450<0.357时判为可疑。敏感性、特异性和可重复性试验证明,该检测方法敏感性高、特异性强和可重复性好。结论:该研究表明建立的间接ELISA方法为猪源嗜血支原体的检测和区域流行病学调查提供了一种快速简便的血清学诊断方法。更多还原