胞外生化-力学信号调控成纤维细胞行为的动态定量分析

【作者】 徐越； 熊春阳； 杨春；

【机构】 清华大学航天航空学院； 北京大学工学院；

【摘要】 细胞周围微环境能够调控细胞的增殖、分化、迁移、凋亡等行为,力学环境对细胞的影响近年来受到广泛关注。近年发现胞外生化信号的改变会影响细胞对力学信号的响应。胶原蛋白包被的硬基底能够诱导骨髓间充质干细胞成骨分化,而用纤连蛋白包被同样弹性的基底则没有该作用。另有研究组发现,癌细胞的迁移能力在纤连蛋白上会受到基底弹性的影响,而在胶原蛋白上对基底弹性没有响应。以上结果提示,胞外基质的生化和力学信号对细胞调控是相互耦合的。细胞通过黏着斑与胞外基质相连。黏着斑是一种大分子蛋白复合体,包括跨膜蛋白整合素及多种胞浆蛋白,一端与细胞骨架相连,另一端则与胞外基质蛋白结合。细胞通过黏着斑将胞外信号传递到胞内,致使肌动蛋白丝介导的细胞牵引力发生变化,响应胞外基底弹性。细胞牵引力还受到胞外基质蛋白组分的影响。这些研究提示,细胞牵引力的变化可能在细胞对周围生化和力学环境耦合响应中起到关键作用。本文以小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)为例,设立纤连蛋白和胶原蛋白包被的软/硬弹性基底四个实验条件,考察胞外生化和力学环境对细胞铺展粘附和牵引力动态变化的耦合影响,为研究牵引力在细胞与周围环境互作机制中扮演的角色寻找线索。本文使用激光扫描共聚焦显微镜对接种在弹性基底上的细胞进行静态定性观察,并设计了一种基于区域分割的统计方法,定义"区域半径"参数对细胞形态进行定量分析。结果显示贴壁早期,成纤维细胞在纤连蛋白包被的基底上铺展面积更大且呈树枝状形态,而在胶原蛋白上呈相对圆滑的形态。充分贴壁后,纤连蛋白和胶原蛋白上的细胞形态无明显差别。考虑到细胞早期贴壁是一个高度动态的过程,我们对成纤维细胞在弹性基底上的粘附和铺展进行动态分析。用显微镜拍摄时间序列图像做定性观察发现,纤连蛋白上细胞伪足延伸更长且呈现更剧烈的动态变化,而胶原蛋白上细胞伪足较短且长度变化不剧烈。有趣的是,细胞在软/硬基底上呈现不同的动态变化形式。硬基底上伪足持续延长或缩短,而软基底上则出现延长缩短交替的"振荡"变化。我们设计了"动态幅值"和"持续系数"两个参数对细胞黏附铺展的动态变化进行定量分析,前者衡量伪足动态变化的剧烈程度,后者指示伪足是否处于"振荡"变化的状态。结果显示低浓度纤连蛋白包被的基底上细胞的动态变化较其它实验组更剧烈。提高蛋白的包被浓度会削弱基底弹性和蛋白组分对细胞铺展黏附的影响。鉴于细胞铺展形态和黏着斑的组成都与细胞牵引力有关,我们引入了改进的高分辨细胞牵引力显微镜技术(high-resolution traction force microscopy,HR-TFM),考察胞外基质弹性和蛋白组分对牵引力的影响。该方法是在弹性基底上均匀铺设荧光小球,细胞通过黏着斑施加牵引力导致基底变形,荧光小球会相应发生位移,通过追踪荧光小球在变形前后位置变化得到基底变形场,利用弹性力学中半无限大空间的Boussinesq解得到牵引力场,分辨率约为1.4微米,可以计算单个伪足内的牵引力场分布。结果显示细胞在纤连蛋白上静态整体牵引力大于胶原蛋白。对于相同组分的低浓度蛋白包被基底,软基底上的细胞静态整体牵引力大于硬基底。细胞黏附铺展的动态分析显示细胞形态对基底弹性的响应在纤连蛋白上相较胶原蛋白更敏感,细胞铺展粘附和细胞牵引力密切相关,但我们在高浓度纤连蛋白包被的基底上没有观察到细胞静态整体牵引力受到基底弹性的影响。文献报道表明,细胞在弹性基底上其黏着斑内牵引力的最大值位置是动态变化的,这一点不能由细胞的静态整体牵引力体现。观察不同基底条件下细胞牵引力的动态变化能够更好的理解细胞对周围环境的响应机制。伪足是细胞骨架和胞外基质蛋白连接的关键部位。我们用显微镜采集时间序列图像,结合HR-TFM得到牵引力场结果,并设计了"伪足牵引力动态幅值"和"局部牵引力动态幅值"两个参数对伪足内牵引力的动态变化进行定量分析,前者代表伪足内牵引力变化的剧烈程度,后者提示了当地分子键是否有活跃的更新。结果显示对低浓度蛋白包被的基底,纤连蛋白包被的软基底较其它实验组伪足内牵引力变化更剧烈,提示当地分子键更新更活跃。对高浓度蛋白包被的基底,纤连蛋白包被的软基底上"伪足牵引力动态幅值"较小,"局部牵引力动态幅值"则较其它实验条件更大,提示在高浓度纤连蛋白包被的软基底上虽然伪足内整体牵引力变化不大,但细胞内部的整合素分子受配体结合键可能有频繁更新。细胞伪足位置有大量黏着斑分布,后者含有丰富的整合素蛋白。我们之前的工作通过体外实验证明基底弹性会影响整合素和胞外基质蛋白分子受配体结合建的寿命。另有报道体内实验发现,斑马鱼血管生成的过程中整合素经历了从细胞膜表面内吞经胞内输运后回到细胞膜其它位置并重新与胞外纤连蛋白结合的过程。我们推测整合素与基质蛋白的结合键寿命及其在胞内的运输可能是影响伪足内牵引力大小稳定性的重要因素。细胞与其周围环境间的相互作用对细胞生命活动有重要影响。细胞内肌动蛋白骨架运动产生牵引力,胞外生化和力学信号通过黏着斑传递到胞内引起细胞骨架变化,牵引力随之改变以响应周围基质的弹性及蛋白组分。本文设计了若干描述细胞铺展和牵引力动态变化的参数,结合高分辨细胞牵引力显微镜技术,分析了成纤维细胞在纤连蛋白和胶原蛋白包被软、硬基底上的动静态特性。相较胶原蛋白,细胞在纤连蛋白上形成铺展面积更大的树枝状形态。低浓度纤连蛋白包被比其它实验条件更容易引起伪足剧烈的动态变化。值得注意的是,细胞在纤连蛋白上的静态整体牵引力不受基底弹性的影响,而伪足内牵引力的动态变化则与基底弹性有关,其中纤连蛋白包被软基底上伪足内牵引力的动态变化相较其它实验组尤其剧烈。因此,细胞的铺展粘附和牵引力的动态变化受到周围基底弹性和蛋白组分的共同调节。细胞与其周围环境相互影响且实时改变,本文使用的动态定量分析方法及高分辨细胞牵引力显微镜技术是分析细胞行为变化的有力工具,能够帮助我们更好的理解细胞与其周围生化-力学环境耦合相互作用的机制。更多还原