生鲜肉肠道病原菌检验中HE和EMB培养基上干扰菌的分离鉴定

【作者】 李滨洲； 陈飞； 何春昊； 郭珍珍； 吴秋玲； 金钺； 王亚宾； 陈丽颖；

【机构】 河南农业大学；

【摘要】 【目的】在对生鲜猪肉中大肠杆菌和沙门氏菌的常规检验中,常用肠道菌培养基HE和EMB琼脂平板上常会出现一些生长良好、菌落特性与目的菌高度相似的可疑菌。因此,有必要通过多种方法进行鉴别/鉴定,以排除其对目标菌株检测的干扰。【方法】在郑州市不同地区的综合性超市和冷鲜肉专卖店分批次采集164份生鲜猪肉样品,按照国标方法进行增菌培养,并使用沙门氏菌选择性培养基HE和大肠杆菌鉴别性培养基EMB对细菌进行分离纯化。观察菌落形态并挑取生长良好的菌落接种于5ml的LB液体培养基中,在37℃摇床上进行恒温培养14h。将纯培养菌划线于普通营养琼脂平板上,挑取单个菌落,用生理盐水稀释后涂片,革兰氏染色并镜检。然后,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对将疑似菌单个菌落进行鉴定,经电离解析飞行时间质谱得出菌株图谱,与数据库里标准菌株质谱图进行比对分析,得出鉴定结果。同时,提取被检菌株基因组DNA,根据MALDI-TOF-MS得出的指示菌株,依据GenBank中相关菌株的部分已知序列,分别设计引物,进行PCR扩增,回收纯化PCR产物并送上海生工生物科技有限公司测序,根据测序结果与GenBank上已知序列进行比对,以验证MALDI-TOF-MS鉴定结果。【结果】经与质谱标准菌株数据库匹配,通过MALDI-TOF-MS方法从68个待检菌株中检出柠檬酸杆菌(Citrobacter)6株、奇异杆菌(Proteobacteria)5株、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)9株、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)1株、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)1株、不动杆菌(Acinetobacter)1株。PCR引物序列分别针对上述6种细菌的特有基因(Idh、ureR、phoE、AmpC、rpoB及Lasl基因),经PCR扩增、1%琼脂糖凝胶电泳和PCR产物测序,分别有9个菌株扩增出柠檬酸杆菌Idh基因(586bp),5株扩增出奇异杆菌ureR基因(374bp),扩增出肺炎克雷伯氏菌phoE基因(369bp)的有11株,具有阴沟肠杆菌AmpC基因(476bp)的为3株,而扩增出不动杆菌rpoB基因(408bp)的为1株,绿脓杆菌LasI基因(600bp)1株。将测序结果与GenBank中收录的各菌株的特异性核苷酸序列比对,柠檬酸杆菌同源性为99.3%~98,1%,奇异杆菌同源性为99.4%~97.7%,肺炎克雷伯氏菌同源性为99.4%~97.7%,阴沟肠杆菌同源性为99.5%~99.3%,不动杆菌同源性为99.6%~98,2%,绿脓杆菌同源性为99.8%~99.3%。PCR鉴定结果与飞行时间质谱鉴定结果一致。【结论】经MALDI-TOF-MS技术与PCR技术检测,在生鲜肉食品中均检验出了6种在HE和EMB培养基上与沙门氏菌/大肠杆菌菌落特征类似的肠杆菌科其他细菌,这些细菌多属于条件性致病菌,其中,奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌等近年来引起人和动物感染的报道不断增多。由此可见,条件致病性肠道细菌在生鲜猪肉中存在着一定程度的污染,有可能会威胁到人体健康,应当对相应的食品安全风险给予重视。更多还原