减毒肠炎沙门菌C50336△sptP△rfbG缺失株的构建与鉴定

【作者】 翟贤月； 焦扬； 孟闯； 耿士忠； 潘志明； 焦新安；

【机构】 扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室农业部农产品质量安全生物性危害因子(动物源)控制重点实验室江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心农业与农产品安全国际合作联合实验室；

【摘要】 【目的】细菌污染是影响食品卫生和安全的主要因素之一,其中沙门菌(Salmonella)污染引起的食物中毒占首位。疫苗在沙门菌防控中有着重要作用。然而在实际生产中,动物接种疫苗后,常无法用简单快速的方法鉴别免疫和自然感染。鉴别疫苗,即DIVA(Differentiation of Infected and Vaccinated Animals)疫苗,是一类亲本株缺少至少一个免疫原性蛋白的疫苗,有望在免疫动物的同时实现鉴别诊断。本研究在肠炎沙门菌C50336△sptP减毒株的基础上构建了LPS相关基因rfbG缺失株,致力于区分免疫动物和白然感染动物,并对其生物学特性和免疫保护进行了评价,探索了rfbG基因在DIVA疫苗设计及其鉴别诊断中的应用潜能。【方法】在肠炎沙门菌C50336△sptP减毒株的基础上利用Red同源重组系统对肠炎沙门菌rfbG基因进行敲除,构建了肠炎沙门菌C50336△sptP△rfbG基因缺失株。同时,对该缺失株进行了基本生物学特性如生长曲线、生理生化等指标进行测定;用吖啶橙溶液及O9抗血清进行凝集反应实验,确定该缺失株的DIVA效果;并且用8周龄雌性BALB/c小鼠采取灌胃的方式进行了免疫保护实验,评价△sptP△rfbG基因缺失株对小鼠的免疫保护情况。【结果】PCR及测序结果表明成功地构建了肠炎沙门菌C50336△sptP△rfbG基因缺失株。rfbG基因缺失株具有沉淀生长的特性,且与吖啶橙有凝集反应而与O9抗原无凝集反应,该反应快速且现象明显,反映了该缺失株有作为DIVA疫苗的潜力。野生株与sptP缺失株的生长速率相对快于rfbG基因缺失株的生长速率,说明rfbG基因的缺失对沙门菌的生长速率有一定影响。小鼠免疫保护实验结果显示,缺失株可以为攻毒后的小鼠提供良好的免疫保护,且C50336△sptP△rfbG免疫组对于野生株的清除具有显著作用。同时,对免疫后小鼠的体重增长情况的监测结果显示,缺失株的免疫对小鼠体重的增长没有显著影响,并且对野生株的攻击免疫组小鼠也能保持良好的生长状态。【结论】C50336△sptP△rfbG不仅具有良好的安全性,同时能提供良好的免疫保护力,为肠炎沙门菌DIVA疫苗研制奠定了基础。更多还原