小鼠MEF细胞氧化应激模型的建立

【作者】 王丽雪； 解玉怀； 张桂国；

【机构】 山东农业大学动物科技学院；

【摘要】 氧化应激是导致细胞衰老的重要因素之一。本试验研究以小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）为模型,构建诱导性细胞氧化应激模型,并分别从细胞、细胞因子、蛋白和基因表达水平检测诱导性细胞衰老模型是否构建成功,检测H₂O₂诱导细胞衰老的时间依赖性和剂量依赖性,并说明氧化应激对细胞造成的损害,了解研究氧化应激诱导衰老的机制,并进一步探索缓解氧化应激的添加剂及其作用机制。试验选用妊娠2周的清洁级昆明种小白鼠,断颈处死小鼠,超净台无菌分离胚胎后,通过剪碎,胰酶消化,去除红细胞等步骤,收集MEF细胞悬液,进行细胞培养。试验设计0、200、400、和600μmol/L的4个浓度梯度的H₂O₂处理分离的小鼠MEF细胞,分别培养24、48、72和96 h,采用衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色法,检测H₂O₂不同添加剂量的MEF细胞的衰老程度,以筛选出H₂O₂刺激MEF细胞构建衰老模型的最佳浓度,并确定刺激的最佳时间。小鼠MEF细胞诱导性衰老模型构建后,对该模型进行验证,使用600μmol/L的H₂O₂处理小鼠MEF细胞,96 h后收集细胞上清液,ELISA检测炎性因子IL-6和趋化因子IL-8的表达量,RT-PCR检测IL-6和IL-8因子的mRNA表达量。收集细胞,裂解细胞后,Western Blot对细胞内部RIG-I和Klotho元件的蛋白表达水平进行测定,RT-PCR检测RIG-I和Klotho基因的mRNA表达水平。结果表明:1)MEF细胞在体外为贴壁生长型细胞、大小不均、异质性较大,原代培养约2¹2 h细胞便逐渐形成完全贴壁状态。胞质向外伸出伪足而形成梭形,多边形,或不规则异形等形状,传代一次后,便可得到纯度较高的MEF细胞。2)H₂O₂的刺激可显著诱导MEF细胞衰老,并在600μmol/L浓度的H₂O₂刺激96 h后,MEF细胞衰老的程度到达90%以上,表现出H₂O₂诱导MEF细胞衰老的时间依赖性和剂量依赖性;小鼠MEF细胞IL-6显著升高（P<0.05）,IL-6基因（P<0.05）与IL广8基因（P<0.05）表达水平显著升高;MEF细胞中klothomRNA表达量显著降低（P<0.05）,RIG-I表达量显著升高（P<0.05）;klotho的蛋白表达量显著降低（P<0.01）,RIG-I的表达量显著升高（P<0.01）。以上结果提示,H₂O₂诱导小鼠MEF细胞衰老存在剂量依赖性和时间依赖性,且衰老MEF细胞中IL-6表达显著升高,IL-6与IL-8基因表达水平显著升高;并同时证明klotho的蛋白和mRNA表达水平降低,RIG-Ⅰ的蛋白和mRNA表达水平升高。更多还原