Let-7b通过下调靶基因EDA调控羊驼毛发生长的研究

【作者】 刘宁； 牛姝； 曹校瑞； 程笳琪； 高淑媛； 于秀菊； 王海东； 董常生； 赫晓燕；

【机构】 山西农业大学动物科技学院；

【摘要】 羊驼被毛品质佳,耳部毛发主要以粗毛为主,生长周期长;背部以细毛为主,生长周期短。研究显示EDA信号通路在皮肤发育及毛发生长过程中有一定的调控作用。为了研究EDA对羊驼毛发生长的影响,同时从MicroRNA水平探索let-7b与EDA的靶向关系以及let-7b对EDA的调控关系,本实验以青年雄性羊驼为研究对象,首先利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测EDA在羊驼耳部、背部皮肤的表达差异,免疫组织化学定位EDA蛋白在羊驼耳部、背部皮肤的表达位置,从而探索EDA对羊驼毛发生长调控的作用;其次构建双荧光报告载体,验证let-7b与EDA的靶向关系;最后使用let-7b真核过表达载体转染羊驼皮肤成纤维细胞,检测转染后细胞中EDA的表达水平,旨在探索let-7b对EDA的调控作用方式。实验结果如下:实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术结果显示EDA rmRNA和蛋白水平在羊驼耳部皮肤相对表达量均显著高于背部皮肤(P<0.01);免疫组织化学结果显示,EDA在羊驼皮肤毛囊的毛根鞘部位强阳性表达,毛基质弱阳性表达,数据分析得到耳部皮肤的平均光密度值高于背部皮肤,差异极显著(P<0.01)。双荧光素报告载体结果显示实验组荧光素表达量下降,表明let-7b与EDA具有明显的靶向关系。let-7b真核表达载体转染羊驼皮肤成纤维细胞后,实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术结果显示转染组中EDA mRNA表达量显著下降(P<0.01),蛋白表达量也下降(P<0.05)。细胞免疫组织化学结果显示:EDA在成纤维细胞质中大量表达,并且在转染的细胞中阳性反应比未转染细胞中弱。以上实验结果提示,EDA在羊驼耳部和背部皮肤毛发中差异表达,推测EDA对羊驼毛发的生长起到了一定的作用;EDA是let-7b作用的靶基因,且let-7b可能通过转录阻遏下调EDA mRNA和蛋白的表达。更多还原