牛精原干细胞的分离培养和组蛋白H3K9三甲基化修饰研究

【作者】 蔡桓； 赵欣欣； 汪正铸； 马晓玲； 唐博； 李子义； 张学明；

【机构】 吉林大学动物医学学院； 吉林大学第一医院/转化医学研究院；

【摘要】 精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是成体内能持续批量更新并将基因传至子代的天然成体干细胞,在干细胞生物学和医学研究及畜牧业生产、濒危动物保护等方面有广阔应用前景。目前有关鼠、人等SSCs的培养、鉴定、更新、分化等研究己取得显著进展,但有关大家畜特别是牛SSCs的研究仍有很多问题,如取材不便、特异性标记有争议、培养体系不成熟、干细胞特性难以维持等。本室前期己报道了牛睾丸组织冻存和精原细胞初步分离富集。本研究进一步对牛睾丸组织的冻存、SSCs分子标记、分离富集、培养、组蛋白甲基化修饰等进行探究。结果显示,血清替代物可替代胎牛血清用于睾丸组织冻存,组织复苏后结构完整、清晰,可用于精原细胞的分离富集。荧光定量PCR显示,牛生精上皮表达一定水平的多能性基因(Oct4、Sox2、Nanog)和较高水平的生殖细胞标记基因(Gfrα-1、Plzf);免疫荧光染色显示,牛曲细精管细胞中有GFRα-1信号,可作为牛SSCs的标志物。进而制备了生精上皮细胞悬液,进一步探讨了差异贴壁法和Percoll密度梯度离心法对牛SSCs富集的效果,GFRα-1标记后流式分析显示,联合使用这两种方法可有效提升牛SSCs的富集度。鉴于近年来小分子抑制剂(如CHIR99021和PD0325901,分别为细胞外调节蛋白激酶ERK和糖原合成激酶3βGSK3β的抑制剂,合称2i)在胚胎干细胞和诱导多能性干细胞中的重要作用,本研究探讨了2i培养体系对牛SSCs干性的维持效果。荧光定量PCR显示,2i条件显著上调了多能性基因(Oct4、Sox2、Nanog)、SSCs标记基因(Gfrα-1、Plzf)、抗凋亡基因(Bcl2)及白血病抑制因子受体基因(LIFR)的表达,而抑制精原细胞分化基因(c-kit)和促凋亡基因(Bax)的表达,同时也提升了SSCs标志物PLZF的表达;用双氧水诱导SSCs凋亡,发现2i能有效抵御凋亡刺激。以上结果提示2i条件有利于牛SSCs体外培养中干性的维持。由于组蛋白甲基化修饰与小鼠SSCs的干细胞状态有密切关系,本实验还初步探究了2i条件对牛SSCs组蛋白H3赖氨酸(K9)三甲基化修饰(H3K9me3)的影响。结果显示,2i能显著降低其H3K9me3水平;培养的牛曲细精管组织中表达组蛋白甲基化酶Suv39h1、Suv39h2、SetDB1和Kdm4A基因;荧光定量PCR显示2i条件显著降低Suv39h1/h2的表达。这提示2i条件可能通过Suv39h1/h2介导牛SSCs的H3K9me3修饰。综上,本研究在冷冻保存牛睾丸组织、分离、富集、鉴定SSCs的基础上,初步证实了小分子抑制剂2i在牛SSCs干性维持中的作用及其对SSCs组蛋白H3K9me3表观修饰水平的影响,为后续研究奠定了基础。更多还原