基于锁式探针快速检测玉米细菌性枯萎病菌和内州萎蔫病菌研究

【作者】 李志锋； 冯建军； 吴绍精； 王忠文； 程颖慧；

【机构】 广西大学农学院； 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心； 深圳市检验检疫科学研究院；

【摘要】 玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartii,PSST)和玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis,CMN)是两种主要为害玉米维管束的毁灭性细菌。随着我国进口玉米种子逐年增加,这两种细菌传入我国的风险越来越高,并且被列入2007年颁布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。因此,针对玉米产品上这两种细菌建立一种特异性强、灵敏度高的二重检测方法,既是快速通关的需要,也是严格检疫和保护我国玉米安全生产的需要。本研究根据PPST的CpsD基因和CMN的ITS基因序列分别设计了PPSTPLP和CMN-PLP锁式探针,建立二重滚环扩增体系,并利用生物素标记的下游引物进行扩增,将扩增产物与偶联上微球的捕获探针进行特异性杂交,最后利用液相悬浮芯片仪进行检测。结果表明:第一,16株供试单一或混合菌株样品中,该二重检测体系可在同一反应同时检测出CMN与PSST协同混合DNA模板,也可检测出单一靶标菌DNA模板,而近似种或其他属供试菌株检测结果呈阴性;第二,通过对菌株CMN和PSST混合配制的10~2-10~8 CFU/mL的不同梯度菌悬液进行二重检测,该体系能够检测到菌悬液浓度阈值为10~3CFU/mL,同时相互之间无交叉反应:第三,该二重检测体系3次重复试验的平均荧光值变异系数均小于10%,表明具有良好的重复性;第四,通过系列梯度浓度的纯菌悬液混合健康种子浸泡液检测,在所有处理样品中利用二重检测方法可同时检测到该混合浸泡液体系中含有1×10~5 CFU/mL的CMN和1×10~4 CFU/mL的PSST,而对应的常规PCR检测结果均为阴性。因此,本研究所设计的特异的锁式探针建立的玉米细菌性枯萎病菌和玉米内州萎蔫病菌的二重检测方法是一种特异性强,灵敏度高的检测新方法,可为进境玉米检疫提供新的技术保障。更多还原