番茄褪绿病毒的RT-PCR检测及SYBR Green I实时荧光定量方法的建立与应用

【作者】 孙晓辉； 高利利； 王少立； 王雪雨； 杨园园； 竺晓平；

【机构】 山东农业大学植物保护学院山东省蔬菜病虫生物学重点实验室；

【摘要】 为了建立检测番茄中番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)的实时荧光定量方法。根据ToCV热激蛋白70(HSP70)的基因序列,设计了ToCV实时荧光定量RT-PCR的特异性引物,获得了190bp大小的片段,并将小片段克隆到pMD18-T载体上,鉴定结果显示,PCR扩增获得片段与ToCV HSP70基因部分片段同源性高,表明设计的引物特异性好且该片段已经成功连接至载体,获得了重组质粒ToCV-1。通过对退火温度和引物浓度的优化,最终确定退火温度为63℃,引物浓度为0.2μmol/L。选择5个梯度稀释的ToCV-1进行SYBR Green I实时荧光定量PCR反应,获得的标准曲线线性关系良好,相应的回归方程为Ct=-3.227Log(copy number)+49.508。熔解曲线为特异性的单峰,且没有明显的非特异性扩增或引物二聚体的峰出现,证明该方法特异性良好。通过与普通PCR的灵敏度比较发现建立的荧光定量PCR比普通PCR灵敏100倍。同时与瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus,CMV)、番茄花叶病毒(Tomato masaic virus,ToMV)和番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)均无交叉反应;组间和组内变异系数均小于5%,表明该方法具有良好的重复性和稳定性。针对不同感病植株不同部位病毒相对含量比较,茎的韧皮部中含量最高,老叶次之,然后是根部,而上部新叶病毒量最低;不同品种番茄供试样品中粉果番茄品种抗病性比红果番茄品种抗病性差;采用粉虱接种法对健康植株接种番茄褪绿病毒,在第四周病毒含量大幅度增加。研究建立的基于SYBR Green I实时荧光定量PCR技术的快速检测方法速度快、特异性强、灵敏度高、重复性好。更多还原