基于锁式探针的密执安棒状杆菌高通量检测方法研究

【作者】 李志锋； 冯建军； 吴绍精； 王忠文； 程颖慧；

【机构】 广西大学农学院； 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心； 深圳市检验检疫科学研究院；

【摘要】 密执安棒状杆菌(Clavibacter michiganensis)为放线菌目、微球菌科、密执安棒状杆菌属,是重要的植物病原细菌。其中,密执安棒状杆菌的5个亚种:Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis(缩写CMN)、Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis(缩写CMM)、Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus(缩写CMI)、Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus(缩写CMS)、Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius(缩写CMT),危害性大、寄主分布广,并且5个亚种的形态学特征近似,鉴别很难,其中前4个亚种是我国进境植物检疫性有害生物。因此,密执安棒状杆菌属是目前检验检疫研究的重点。本研究根据ITS和celA基因序列分别设计了CMN-PLP、CMM-PLP、CMI-PLP、CMT-PLP和CMS-PLP等5条锁式探针(已申请国家发明专利),建立五重滚环扩增体系,并利用生物素标记的下游引物进行扩增,将扩增产物与偶联上微球的捕获探针进行特异性杂交,最后利用液相悬浮芯片仪进行检测。结果表明:①20株供试菌株中,仅靶标菌能与相对应的锁式探针特异性结合,并且当混合样品中同时含有4种、3种或者2种靶标菌时,五重检测体系均可同时检测出对应微球显示阳性信号,而近似种或其他属供试菌株检测结果呈阴性;②建立的五重检测体系可以在一个反应管中同时检测五种混合供试靶标菌,也可检测出单一靶标菌DNA,其检测灵敏度阈值为100fg/μL,同时五对锁式探针相互之间无交叉反应;③该五重检测体系三次重复试验的平均荧光值变异系数均小于10%,表明具有良好的重复性。因此,本研究中基于锁式探针的5种密执安棒状杆菌悬浮液相芯片检测技术具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点,解决了常规多重检测中加入多对引物造成体系优化的困难,为密执安棒状杆菌的分类鉴定提供了为新的方法和技术支持。更多还原