HPV E7基因沉默对细胞表面HLA经典Ⅰ类分子表达的影响

【作者】 李伟； 王传新；

【机构】 山东大学齐鲁医院检验科；

【摘要】 目的流行病学和分子生物学研究证实高危型HPV感染是宫颈癌的主要致病因子,病毒早期基因E6和E7编码主要致病癌蛋白。课题组前期研究表明HPV E7可以下调HLA-Ⅰ类分子和抗原加工相关转运因子1(TAP-1)。本实验研究用小干扰RNA(siRNA)技术基因沉默HPV E7,并且探讨沉默后的HaCaT-E7细胞表面HLA经典Ⅰ类分子和胞内TAP-1的表达情况。方法 1.siRNA的筛选和转染,化学法合成3条HPV16 E7特异性siRNA,应用Lipofectamine 2000将其转染入HaCaT-E7细胞,24h后收集细胞,实时荧光定量PCR检测HPV16 E7 mRNA的表达水平,分析各个siRNA的作用效果,筛选出抑制效果最好的siRNA。对数生长期正常HaCaT细胞、HaCaT-E7细胞、HaCaT-pCMV细胞应用转染试剂Lipofectamine 2000分别转染该siRNA。转染4h后更换完全培养基,于37℃,5%CO2条件培养细胞,用于不同时间点的检测。2.流式细胞术检测细胞膜表面HLA-Ⅰ类分子的表达,正常HaCaT细胞、HaCaT-E7细胞、HaCaT-pCMV细胞转染siRNA 24h、48h、72h后,0.25%胰酶消化后,用含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS(PBS-B)重悬,加入20μL抗HLA-ABC-FITC或抗KLH-FITC(同型对照),混匀后避光静置20min,2mLPBS-B冲洗,400μLPBS-B重悬,流式细胞仪检测。3.流式细胞术检测细胞内部抗原处理相关转运蛋白TAP1的表,正常HaCaT细胞、HaCaT-E7细胞转染siRNA72h后,0.25%胰酶消化,Fixation/Permeabilization破膜处理,PBS-B重悬,20μL鼠抗人TAP1单克隆抗体作用30min,Perm/Wash buffer冲洗,1:100稀释的羊抗鼠IgG-FITC抗体重悬,暗室涡旋混匀30min,Perm/Wash buffer冲洗两遍,400μL PBS-B重悬,上机检测。以荧光二抗为同型对照。结果转入HPV16 E7-siRNA48小时后可以在蛋白水平和RNA水平检测到HPV E7的表达下调(P<0.05,P<0.05)。流式细胞术的结果标明,相对与对照组转入HPV16 E7-siRNA后HaCaT-E7细胞表面的HLA-Ⅰ类分子上调(P<0.05),且呈现时间依赖性,转入后72小时大约上调76%;并且基因敲除E7的HaCaT-E7细胞胞内的TAP-1增加(P<0.05),这对细胞表面HLA-Ⅰ类分子的表达有重要作用。结论化学合成的HPV16 E7特异性siRNA能有效抑制HaCaT-E7细胞中E7 mRNA的表达,可使HaCaT-E7细胞表面HLA-Ⅰ类分子的表达随时间上调,72h时达正常HaCaT细胞水平,预示着siRNA干扰技术可增加CTL对HPV感染细胞的清除机会,增强细胞的免疫原性。siRNA抑制HPV16 E7 mRNA表达后,HaCaT-E7细胞内部TAP1表达水平升高,72h时达正常HaCaT细胞水平。靶向人乳头瘤病毒HPV16 E7的siRNA沉默技术为宫颈癌的基因治疗提供了新的思路。更多还原