携带HR-GFP报告基因的DNA损伤同源重组修复检测系统的建立及初步应用

【作者】 李莎； 王欢； 任来峰； 郭连娣； 刘聪； 丁娜娜； 李婉宜； 李明远；

【机构】 四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室； 四川大学华西第二医院发育与干细胞研究所；

【摘要】 目的:建立DNA损伤同源重组修复检测系统(I-SceI-HR),应用该系统制备DNA双链断裂(DSB)的人骨肉瘤细胞(U2OS)模型,探索细胞DNA损伤后的修复特性奠定基础。方法:通过分子克隆构建携带I-Sce I归位内切酶识别序列的真核表达载体pcDNA3-HR-GFP,将该质粒转染入U2OS细胞中,经G418稳定筛选。随后分别瞬时转染入携带归位内切酶I-Sce I的表达质粒pCBASCEI,以及体外经I-Sce I线性化pcDNA3-HRGFP。48h后用免疫荧光方法检测DNA双链损伤效应分子——γ-H2AX,同时观察EGFP荧光信号;72h后用Western blot检测报告蛋白EGFP的表达,评估DNA双链断裂后同源重组修复情况。结果:酶切鉴定和测序证实pcDNA3-HR-GFP真核表达载体构建成功;I-Sce I-HR系统引入U2OS细胞中后,γ-H2AX表达明显上调,荧光显微镜和Western blot均显示EGFP表达。结论:DSB细胞同源重组修复模型构建成功,I-Sce I-HR系统能够成功地诱导U2OS细胞株产生DSB,并出现同源重组修复,为进一步研究DNA同源重组信号传导提供有效的研究工具。更多还原