HBHA蛋白在结核病诊断中应用研究

【作者】 周珊； 徐修礼； 马越云； 刘家云； 孙怡群； 郝晓柯；

【机构】 第四军医大学西京医院检验科；

【摘要】 目的:制备天然肝素结合血凝素(HBHA)蛋白,构建重组质粒原核表达纯化HBHA蛋白,并比较天然蛋白和重组蛋白的聚集BCG活性。探讨其在结核杆菌感染诊断中的应用价值。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出HBHA基因片段。结核分枝杆菌HBHA基因克隆至PE80L克隆表达载体中,构建PQE80L-HBHA重组质粒,经BamHⅠ与HindⅢ双酶切2小时,1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确后进行测序。将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL-21株,重组菌经0.3 mmol·L-1IPTG诱导5小时。将IPTG诱导后400ml菌液10000rpm离心5min收菌,弃上清,用binding buffer重悬,冰浴条件下超声5次,每次10秒,分别收集裂解沉淀和上清,加2×上样缓冲液混匀,煮沸10min,12000g离心5min,上清进行SDS-PAGE。重组蛋白多出现在破碎后的上清中,表明以可溶性形式存在。将超声裂解后的上清通过已用Binding buffer平衡的Ni-琼脂糖柱上,再用10ml的Binding buffer冲洗柱子,最后用3ml的Elution buffer将蛋白洗脱并收集蛋白。并以此rHBHA免疫新西兰兔制备多克隆抗体。同时,将7H9液体培养基中的卡介苗(BCG)培养至稳定生长期,离心收集BCG菌体,用PBS重悬菌体加入Triton X-100,冰浴条件下超声10次,每次30秒,在-70℃和37℃反复冻融数次。然后,继续超声10次。13000g离心30分钟,留取上清,将上清通过已用PBS平衡的Heparin Sepharose CL-6B,再用100mLPBS冲洗柱子,用不同NaCl盐离子浓度梯度的PBS将nHBHA洗脱,收集各浓度梯度洗脱蛋白。取少量样品进行SDSPAGE电泳,并用Western blot鉴定天然HBHA蛋白(nHBHA),证实得到nHBHA蛋白。然后用不同浓度的(0,0.2,0.5,2.0,5.0)ug·mL-1rHBHA和nHBHA分别加入到培养BCG的7H9液体培养基中,36小时后观察其诱导BCG聚集情况。同时,将HBHA蛋白与抗HBHA抗体以最适比例37℃孵育一小时后,再将孵育过的蛋白加入到BCG培养基中,36小时观察抗体对不同浓度nHBHA和rHBHA诱导BCG聚集效应的影响。结果结核分枝杆菌HBHA基因成功地克隆到PQE80L克隆表达载体中,并在E.coliBL-21中获得了高效表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过亲和层析法纯化获得的蛋白纯度大于92%。天然HBHA蛋白提取在梯度洗脱时,含有342mmol·L-1NaCl的PBS洗脱获得纯度较高的nHBHA。所得天然和重组蛋白均有诱导BCG聚集的作用,并且天然HBHA诱导聚集能力强于重组HBHA蛋白,此种凝集均可被抗HBHA多克隆抗体抑制。结论成功获得天然HBHA和重组HBHA蛋白;证实了两者均具有促进BCG聚集的功能,并可被由重组HBHA诱导产生的多克隆抗体所抑制。该抗体能结合nHBHA的实验结果提示,该抗体及rHBHA在检测血液中相应的HBHA抗原和抗体中具有潜在临床诊断价值,从而为进一步研究HBHA的临床诊断价值提供了实验依据。更多还原