木质素降解酶的催化机理及应用研究

【作者】 余洪波； 孔雯； 李飞； 史黎黎； 倪浩翔； 马富英； 张晓昱；

【机构】 华中科技大学生命科学与技术学院；

【摘要】 白腐菌（White rot fungus）是自然界中唯一可以完全降解木质素的一类微生物。其高效木质素降解能力依赖于一系列木质素降解酶的非特异性氧化反应。木质素降解酶的非特异性催化特征,使其在生物能源、环境处理、造纸制浆和食品工业等领域具有广泛的应用前景^1-3。本研究从自然界中筛选获得一系列新型高效木质素降解酶,包括锰过氧化物酶（Manganese Peroxidase,MnP）、漆酶（Laccase,Lac）、多功能过氧化物酶（Versatile Peroxidase,VP）、染料脱色过氧化物酶（Dye Decoloring Peroxidase,DyP）^4-6,系统研究了木质素降解酶的性质并揭示其催化木质素降解的反应机理;在此基础上,一方面构建了木质素降解酶和纤维素酶协同转化木质纤维素的复合糖化体系,另一方面利用固定化漆酶实现抗生素污染物的高效降解。从高效木质素降解白腐菌中分离纯化出8个木质素降解酶,克隆获得4个木质素降解酶基因并在毕赤酵母中实现异源表达。这12个木质素降解酶包括6个Lac、2个MnP、3个VP和1个DyP。系统研究了这些木质素降解酶的发酵工艺、酶学性质和反应动力学特征。其中,Lac-E2538具有较强的热和pH稳定性及有机溶剂耐受性;多功能过氧化物酶VP-EPF18和锰过氧化物酶E2548-MnP可直接氧化非酚性木质素底物,VP-EPF18氧化还原电位高达1.39eV。分别研究了四类木质素降解酶降解木质素高分子的机理。发现Lac和MnP对木质素单体的降解具有一定偏好性,Lac只能降解酚型的木质素结构单元,而MnP可以同时降解酚型和非酚型的木质素结构,但降解速率慢于L ac其中,Lac-E2538可以在没有介体的条件下去除木质素甲氧基并断裂β-0-4醚连键,当Lac和MnP协同催化时,木质素降解增强。VP和DyP均表现出广谱的芳香族化合物和污染物的降解能力,可以催化高氧化还原电位底物如藜芦醇的降解;可以催化木质素高分子的苯环开环、C-C和C-O连键断裂、木质素单元侧链的氧化。合成制备了木质素二聚体模型化合物,研究VP和Lac解聚木质素的机理,结果发现:VP不仅能催化β-0-4类型二聚体的解聚降解,还可以断裂5-5类型二聚体的C-C连键;而Lac可以导致酚型木质素解聚产物的重聚合,抑制了木质素的高效降解。进一步利用白腐菌木质素降解酶与商品纤维素酶复配构建木质纤维素复合转化体系,较单一纤维素酶转化系统糖化效率显著增强。依木质纤维素种类、木质素降解酶来源和复合方式不同,糖化率增强幅度在10%-50%之间,最高糖化率达到90%以上。另一方面,制备了功能化的Fe₃O₄磁性纳米粒子作为漆酶固定化载体,研究固定化漆酶对抗生素废水中残留的新型污染物磺胺类药物的降解能力。结果发现漆酶固定化后提高了其对介体的亲和力和反应催化效率,对磺胺类药物的清除速率明显增加,清除效率还与介体被氧化形成自由基的稳定性有关。反应产物的分析表明:漆酶介导介体形成酚羟自由基,酚羟自由基进而作用于磺胺类药物苯环上的对位氨基发生了杂合偶联,抑菌性检测发现,处理后抗生素废水失去了抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活性,从而解除其环境危害。本研究对木质素降解酶催化理论的完善和发展及在环境、生物能源领域的应用具有重要意义更多还原