基于QMMM计算的腈水解酶主/副产物精准切换

【作者】 姜水琴； 张鲁嘉； 魏东芝；

【机构】 华东理工大学生物工程学院生物反应器工程国家重点实验室鲁华生物技术研究所；

【摘要】 腈水解酶(EC 3.5.5.1)直接将腈转化成相应的羧酸和NH3,因其高化学特异性和对映体选择性,在精细化学品和药物中间体生产中已经被广泛认为化学催化剂的优良替代品,受到越来越多关注。研究发现腈水解酶能够催化底物腈生成主产物羧酸和副产物酰胺,酰胺副产物的存在已经成为限制腈水解酶工业化应用的一个重要影响因素,但为酰胺的酶法合成提供了新契机。2-吡啶甲酰胺、α-羟基酰胺和β-羟基酰胺等酰胺化合物是重要的功能化学分子,广泛用于医药及精细化学品的有机合成。美国化学学会绿色化学研究所制药圆桌会议(ACS GCIPR)将酰胺合成视为目前制药领域亟待解决的合成问题,并将其定为优先研究领域。酰胺的酶法生产主要依赖与腈水合酶,而腈水合酶的底物大多局限于脂肪族腈,其手性选择性和热稳定性较差,属于金属依赖型酶且对底物腈敏感。此外,腈水合酶的重组表达需要共表达激活蛋白,因此开发性能更好的能够催化腈类生成酰胺的酶分子催化剂具有重要价值。与腈水合酶相比,腈水解酶手性选择性更高、底物谱更广、异源表达无需激活蛋白、催化反应无需金属离子。腈水解酶同时具备腈水合酶活力的现象为酰胺(尤其光学纯酰胺)的酶法高效生产提供了新契机。课题组从实验室腈水解酶库中挑选出一株具有较高应用价值的Nit6803腈水解酶,成功获得了目前PDB数据库中报道的国际第二个腈水解酶晶体结构。基于腈水解酶催化机理的分析、过渡态中间体NAC模型的构建结合分子动力学模拟技术以及QMMM势能垒计算,设计获得了产物中酰胺比例高于野生型的五个突变体,其中四个突变体终产物中酰胺比例高于50%,效果最好的突变体F193N,酰胺比例提高至73%,酰胺合成量是野生型的35倍,催化活力保留了野生型的50%,初步实现了腈水解酶到腈水合酶的切换;初步揭示了腈水解酶反应调控机制在于催化过程中过渡态中间四面体上氨基与巯基的质子化竞争,而193位点以空间位阻的模式,影响周围氨基酸的构象、氢键、静电作用及芳香作用,进而影响了过渡态中间四面体上巯基和氨基的质子化竞争,最终影响产物中酰胺和羧酸的比例。该工作首次揭示了腈水解酶副产物形成机制,采用理性设计的方法获得了一种新型的来源于腈水解酶的腈水合酶,为酰胺的合成提供了新方法,为新催化剂的挖掘提供了新思路。更多还原