基于重组酶聚合酶恒温扩增技术的恙虫病东方体快速可视化检测方法的建立

【作者】 齐永； 尹琼； 邵银秀； 李素芹； 陈红霞； 沈万鹏； 饶继先； 李晓玲； 林煜； 孙瑜； 邓艺； 李越希；

【机构】 南京军区军事医学研究所； 中国药科大学药学院； 南京医科大学基础医学院；

【摘要】 目的建立恙虫病东方体重组酶聚合酶恒温扩增(RPA)检测方法,结合侧向层析核酸检测试纸条实现快速可视化检测恙虫病东方体。方法根据恙虫病东方体的56 kDa外膜蛋白基因设计多组RPA引物和探针,以克隆的基因片段为模板,筛选出37℃条件下扩增效率最高的引物、探针组合,并对反应体系、条件进行优化,反应产物通过侧向层析核酸检测试纸条快速显色,建立基于RPA技术和侧向层析核酸检测技术的恙虫病东方体快速可视化检测方法,评价该方法的灵敏度和特异性。结果研究成功筛选到一组特异性引物及探针组合,在37℃条件下扩增效率较高,特异性强。通过优化反应条件,在使用10μM浓度的下游引物和5μM浓度的探针扩增20 min,试纸条显色时间控制在3~5 min时,检测效果最好;该方法灵敏度高,检测限可达到10 copies/μL,检测立氏立克次体、普氏立克次体、黑龙江立克次体、西伯利亚立克次体、金黄色葡萄球菌、猪链球菌的DNA样本反应显示阴性,具有很好的特异性。结论本研究成功建立恙虫病东方体RPA检测方法,该方法耗时短、可在常温(37℃)下实现恒温扩增,灵敏度高,特异性好,设备要求低。该检测技术适用于现场的快速检测,在恙虫病东方体流行地区的基层卫生单位以及突发疫情现场具有应用价值。更多还原