应用CRISPR/Cas9技术对HepG2细胞SYY基因的靶向敲除研究

【作者】 姚志坚； 袁洋洋； 曾思衡； 刘畅； 郭睿； 解军； 孙公勤； 于保锋；

【机构】 山西医科大学生物化学与分子生物学教研室； 美国罗德岛大学细胞和分子生物学系；

【摘要】 CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统,用来抵抗外源遗传物质的入侵,比如噬菌体病毒和外源质粒。同时,它为细菌提供了获得性免疫,这与哺乳动物的二次免疫类似,当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时,会产生相应的"记忆",从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA,并将它们切断,沉默外源基因的表达。其具有靶向性强、剪切效率高的特点,在高效、多位点的基因组定点修饰方面更加具有优势。目前,CRISPR/Cas9技术在基因的功能研究、基因治疗、转基因动物等研究领域具有广阔前景。肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,具有恶性程度高,进展快,预后差,侵袭性强等特点,在引起人类死亡的肿瘤中位居第三,而原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝脏肿瘤中发生频率最高的类型,并且治疗措施十分局限,其发生发展是一个多进展的过程。SYY基因是2004年发现的一种组蛋白甲基转移酶,可以特异性地使染色体组蛋白H3-赖氨酸4形成二甲基化或三甲基化,从而造成染色体空间结构的异常改变,并进而影响下游许多癌基因、细胞周期调控基因、信号转导相关基因等的表达,最终导致细胞增殖速度加快。本研究通过应用CRISPR-Cas9技术,靶向敲除HepG2细胞的SYY基因,构建HepG2细胞的SYY基因稳定敲除的细胞株。根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计三条sgRNA,利用PX459质粒载体,构建真核表达载体。测序鉴定后,利用脂质体将重组PX459转染至HepG2细胞中,使用嘌呤霉素筛选稳定敲除SYY基因的HepG2单克隆细胞株。利用western blot检测重组PX459对SYY基因的敲除效果,MTT检测SYY基因敲除后单克隆细胞株的增殖能力,traswell小室实验检测SYY基因敲除后单克隆细胞株的迁移能力。结果表明成功构建重组PX459质粒,western blot结果表明敲除SYY基因的HepG2细胞内无S蛋白的表达,MTT法表明敲除后细胞增殖能力降低,traswell小室结果表明敲除后细胞的迁移和侵袭能力降低。结论通过CRISPR/Cas9系统获得稳定敲除SYY基因的单克隆细胞株,并且表明SYY基因在肝癌细胞的增殖,迁移,侵袭具有一定的作用。更多还原