细胞膜表面GRP78促进结肠癌转移的分子机制及其靶向药物的开发

【作者】 李宗伟； 张立超； 李卓玉；

【机构】 山西大学生物技术研究所； 山西大学生物医学研究院； 山西大学生命科学学院；

【摘要】 葡萄糖调节蛋白78（Glucose regulated protein 78,GRP78）也称免疫球蛋白重链结合蛋白（Bip）,是Hsp70家族成员。在正常细胞中GRP78主要定位于内质网中,充当内质网应激的感受器,帮助新合成的以及错误折叠的蛋白正确折叠,维持内质网中Ca²⁺的稳态。在肿瘤组织中,由于相应的脉管系统不发达,肿瘤细胞常常处于缺氧、缺糖以及酸性的应激环境。因此,GRP78在肿瘤组织中的表达往往高于癌旁组织。GRP78表达量的升高,使其在肿瘤细胞中的定位发生了明显的变化,尤其是在一些肿瘤细胞的表面,GRP78能够作为受体与α2-M、Par-4、plasminogen kringle 5以及Cripto等蛋白结合介导下游信号,对肿瘤的发生发展有明显的促进作用。然而,GRP78在结肠直肠癌(CR（）细胞表面的定位情况及其在CRC细胞迁移过程中所扮演的角色依然未知。另外,肿瘤细胞膜表面特异性分布的GRP78（sGRP78）也非常适合作为肿瘤靶向药物的输送通道,针对肿瘤细胞sGRP78的靶向药物亟待开发。本研究的第一部分,我们首先发现CRC细胞表面簇状分布有大量的GRP78,并且随着CRC细胞迁移能力的增强,sGRP78也逐渐增多,而利用丁酸钠诱导CRC细胞分化后,sGRP78明显减少。在结肠癌DLD1细胞中过表达GRP78使其在细胞膜上的分布增多后,DLD1细胞的迁移能力明显增强,而用抗体封堵细胞sGRP78可以显著抑制DLD1细胞的迁移能力。这表明sGRP78的分布量与肿瘤细胞的迁移能力以及恶性程度呈正相关,同时也暗示sGRP78参与了肿瘤细胞的迁移等恶化过程。细胞与基质之间形成有力的粘附是细胞迁移的第一步,我们的研究结果显示封堵sGRP78后,结肠癌SW480细胞与基质之间的粘附能力明显减弱,进一步的检测结果显示,GRP78能够与FAK以及integrin-β1形成蛋白复合物,sGRP78可能通过与integrin-β1相互作用激活下游的FAK,最终促进肿瘤细胞与基质之间的粘附。肿瘤细胞在迁移的过程中还需要不断分泌蛋白酶降解周围的基质,为细胞的运动扫清障碍。已有文献报道,GRP78能够与尿激型纤溶蛋白酶原激酶（uPA）的底物纤维蛋白溶酶原（plasminogen）结合。我们的研究结果显示,肠癌细胞中uPA的表达与sGRP78的分布量呈正相关,并且sGRP78能够与uPAR相互作用。结合已有文献报道和本研宄的发现,我们推测sGRP78与plasminogen和uPAR的结合,拉近了uPA与其底物的距离,促进了plasminogen到plasmin的转变,最终促进基质的降解。为了验证上述推测,我们利用Transwell浸润实验检测发现,封堵sGRP78后,细胞的浸润能力明显减弱,并且分泌型MMP-9的活性也显著降低,表明肠癌细胞膜表面GRP78能够激活uPA-uPAR系统,促进细胞浸润。以上研究结果表明,肿瘤细胞中的GRP78能够特异性地定位于细胞膜表面介导多个促肿瘤信号,并且sGRP78分布量与肿瘤的恶性程度呈正相关。这一特征使得sGRP78非常适合作为肿瘤靶向药物的输送通道。亚麻酶胞毒素SubAB₅和GRP78结合肽（GBP）的发现,使针对GRP78的肿瘤靶向药物开发成为可能。SubAB₅的A亚基（SubA）能够特异性的在GRP78的416位和417位亮氨酸中间将其切断,使GRP78失去功能。GBP是由8个氨基酸组成多肽,它们能够特异性的识别并结合细胞sGRP78,进而内化进入细胞。如果能够将上述两者有机的结合起来,实现针对GRP78的肿瘤靶向治疗,将具有极大的开发潜力。本研究的第二部分采用基因工程技术将GBP与SubA的基因融合,以期表达GBP-SubA融合蛋白。然而表达后的重组蛋白GBP-SubA主要以包涵体形式存在,经过复杂的变复性实验,我们最终得到了有活性的GBP-SubA蛋白。用0.1μg/mL的GBP-SubA蛋白处理肝正常细胞HL-7702（膜表面没有GRP78分布）、肠癌细胞DLD1（膜表面有少量GRP78分布）和肝癌细胞HepG2（膜表面有大量GRP78分布）24 h后,我们发现HepG2细胞中GBP-SubA的进入量最多,DLD1细胞其次,而HL-7702细胞中几乎检测不到GBP-SubA。同时,三种细胞中的GRP78蛋白也随GBP-SubA进入细胞量的增多而被降解,表明GBP-SubA具有靶向肿瘤细胞并破坏肿瘤细胞中GRP78的能力,与预期一致。进一步的MTT和流式实验结果显示,GBP-SubA处理48 h能够显著抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡,并且对HepG2细胞的作用最为明显,而HL-7702细胞几乎不受影响,表明GBP-SubA能够特异性地诱导肿瘤细胞凋亡,发挥抗肿瘤效应。为了验证上述结果,我们利用抗体封堵sGRP78,然后再用0.1μg/mL的GBP-SubA处理细胞,发现GBP-SubA对肿瘤细胞的抑制作用显著降低,DNA的断裂以及凋亡小体的产生明显减少,肿瘤细胞凋亡率也明显降低。上述结果进一步证实,重组的GBP-SubA具有靶向肿瘤细胞表面GRP78以及破坏细胞内GRP78的双重生物活性,仅通过GRP78分子就实现了靶向和杀伤肿瘤细胞的双重作用。更多还原