mms13、ScFv(3G11)及其融合基因在大肠杆菌中的表达

【作者】 孔登； 王小柯； 邢秋翠； 陈永； 付新华； 王守训；

【机构】 潍坊医学院生物化学与分子生物学教研室；

【摘要】 目的构建蛋白表达载体pET30a(+)-mms13、pET30a(+)-ScFv和pET30a(+)-ScFv-mms13,将其转入E.coli Rosetta诱导蛋白表达。对表达条件进行优化,并对表达蛋白进行定位分析,通过Western blot鉴定表达蛋白,为重组制备肿瘤靶向细菌磁小体提供转基因载体。方法以克隆载体pMD18-mms13为模板,设计PCR引物扩增mms13基因,产物纯化后NdeⅠ和XhoⅠ双酶切,与相同酶切的pET30a(+)连接构建表达载体pET30a(+)-mms13,测序验证。以克隆载体pMD18-ScFv为模板,PCR扩增ScFv基因,双酶切后与pET30a(+)连接构建表达载体pET30a(+)-ScFv,测序验证。以克隆载体pMD18-mms13和pMD18-ScFv为模板,采用重叠延伸拼接PCR(SOE-PCR)技术构建融合基因ScFv-mms13。进而将融合基因ScFv-mms13与pET30a(+)连接构建重组表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13,测序验证。将以上构建的三个表达载体转化入E.coli Rosetta感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳分析。通过改变IPTG浓度、诱导时间确定最优表达条件,并对表达蛋白进行定位分析。最后通过Western blot鉴定融合基因蛋白表达。结果测序结果表明表达载体pET30a(+)-mms13和pET30a(+)-ScFv构建成功。应用重叠延伸拼接PCR(SOE-PCR)方法构建融合基因ScFv-mms13(1158bp),然后通过克隆技术得到重组质粒pMD18-ScFv-mms13。将融合基因ScFv-mms13插入到pET30a(+)构建了重组表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13;菌落PCR、酶切、DNA测序鉴定结果均表明目的片段准确地插入到表达载体中。以上三种表达载体转化入E.coli Rosetta感受态细胞,诱导后电泳结果显示目的条带分别在13kDa、28kDa、43kDa左右,与预期大小相符。并确定IPTG终浓度为0.2mM、诱导时间6h为最优表达条件。对表达蛋白进行定位分析确定Mms 13蛋白主要存在于可溶细胞质中,ScFv蛋白主要存在于包涵体中,ScFv-mms13重组表达蛋白主要以包涵体形式存在,部分存在于可溶细胞质中。Western blot实验进一步证实了以上三种表达的蛋白为目的蛋白。更多还原