【作者】 程成； 张莹； 张可炜；

【机构】 山东大学生命科学学院/植物细胞工程与种质创新教育部重点实验室；

【摘要】 土壤的盐度限制了土地利用并影响着作物产量。作为1种重要的经济作物,棉花为西北内陆、黄河流域等棉区带来了可观的收益。然而,有限的耕地资源是这些地区棉花生产进一步发展的主要障碍。如果将大量的盐碱地用于棉花种植,这个困难将有望克服。大多数现有棉花品种难以在高盐土地上种植和生长,因此,培育耐高盐棉花品种（系）是解决这一问题的关键。利用农杆菌介导法将拟南芥编码vacuolar Na⁺/H⁺Antiporter的AtNHX1和盐芥编码vacuolar H⁺-pyrophosphatase（V-H⁺-PPase）的TsVP基因导入棉花GK35中,获得了60个独立转化事件,其中转AtNHX1-TsVP基因棉花3个株系AT1、AT2、AT3的T₅代植株用于本研究,其中AtNHX1和TsVP基因已纯合且稳定遗传。PCR分析表明在转基因棉花中存在AtNHX1和TsVP基因而在野生型棉花中缺失。Southern印迹分析表明AtNHX1和TsVP基因整合到棉花基因组中。RT-PCR表明转基因棉花中AtNHX1和TsVP基因活跃表达。Real-time PCR检测发现AtNHX1和TsVP在株系AT3中的表达水平最高。温室中种子沙培出苗实验结果表明,对照（无NaC1）条件下的转AtNHX1-TsVP基因棉花和野生型棉花（WT）的出苗率没有显著差异。当NaC1浓度大于50 mmol·L^-1时,野生型和转基因棉花的出苗率都降低。当NaC1浓度大于100 mmol·L^-1时,播种10 d后转基因棉花的出苗率显著高于WT。当NaC1浓度小于100mmol·L^-1时,转基因和野生型棉花的ED₅₀（50%出苗时间）没有显著差异。当NaCl浓度大于100mmol·L^-1时,转基因棉花（AT1AT2和AT3）的ED₅₀显著小于WT,即转基因棉花与野生型相比有更高的出苗率和更短的50%出苗时间,过表达AtNHX1-TsVP基因可以提高棉花种子在盐胁迫条件下的出苗率。在山东省东营市河口区新建村试验地,在土壤含盐量3.82 g·kg^-1的大田中（2014年）,野生型在播种后第8天开始出苗,转基因棉花在播种后第6天开始出苗。3个表达AtNHX1-TsVP基因的株系具有比野生型（出苗率28.24%,成苗率25.12%）更高的出苗率（52.18%⁵6.95%）和成苗率（48.32%⁵3.26%）。在土壤含盐量3.71 g·kg^-1的大田中（2015年）,野生型在播种后第10天开始出苗,转基因棉花在播种后第8天开始出苗。3个转基因株系具有比野生型（出苗率30.82%;成苗率25.46%）更高的出苗率（50.05%⁵6.67%）和成苗率（46.65%⁶2.76%）。两年试验结果表明,转基因棉花与野生型对照相比具有更短的出苗时间、更高的出苗率和成苗率,转基因棉花表现出更好的耐盐性。盐胁迫下种子出苗结果显示,与野生型棉花相比转AtNHX1-TsVP基因棉花更适宜于盐碱地种植。2014年转基因株系AT1、AT2和AT3在河口区新建村盐碱地籽棉产量分别比野生型增加22.12%、20.48%和25.01%。2015年的田间试验获得的结果与2014年类似,AT1、AT2和AT3的籽棉产量与野生型相比分别增加20.02%、21.98%和25.21%。因此,这3个表达转基因株系在盐碱地条件下表现出更好的经济产量和耐盐性。在温室溶液培养条件下,共表达AtNHX1和TsVP基因增加了棉花细胞中Na⁺、K⁺和Ca²⁺水平。在正常条件下（无NaCl）AT1、AT2、AT3叶片中Na⁺⁺、K⁺和Ca²⁺含量显著高于WT,分别提高8.35%¹1.36%、10.65%¹2.91%、26.46%³5.35%。随着培养液中NaCl浓度的增加,AT1、AT2、AT3和WT植株的叶片中Na⁺浓度显著增加,且转基因株系中Na⁺的增加幅度相对较大。在250 mmol·L^-1NaCl溶液培养条件下生长14 d,株系AT1、AT2、AT3叶片的Na⁺浓度比WT高19.46%²5.26%。转基因株系AT1、AT2、AT3和WT叶片中的K⁺、Ca²⁺浓度随着培养液中NaCl浓度的升高而下降,但转基因株系叶片的下降幅度相对较小,K⁺、Ca²⁺浓度显著高于WTo在250 mmol·L^-1NaCl条件下生长14 d,AT1、AT2、AT3叶片中K⁺、Ca²⁺浓度比WT分别高45.66%⁶5.53%和44.56%⁵2.93%。这说明NaCl胁迫下转基因棉花细胞具有保留更多K⁺、Ca²⁺的能力。不同NaCl浓度处理下转基因棉花AT1、AT2、AT3叶片的K⁺/Na⁺更高。当NaCl胁迫14d,野生型对照的K⁺/Na⁺值比株系AT1、AT2、AT3低19.74%²2.35%(125 mmol·L^-1NaCl)和23.71%²6.78%(250 mmol·L^-1NaCl)。转基因株系AT1、AT2、AT3和WT播种在东营河口盐碱地中(土壤含盐量为3.71 g·kg^-1;土壤中Na⁺含量为0.82 g·kg^-1;2015年),植株叶片积累较高的Na⁺。与WT相比株系AT1、AT2、AT3叶片中Na⁺、K⁺和Ca²⁺含量分别增加了28.57%³8.77%、11.37%²0.46%、12.50%²1.87%。转基因株系AT1、AT2、AT3的K⁺/Na⁺比WT分别提高了16.09%、15.45%和15.23%。盐碱地中转基因棉花中Na⁺、K⁺、Ca²⁺含量和K⁺/Na⁺的变化趋势与室内溶液培养实验结果一致,在盐胁迫下转基因株系叶片细胞中具有更高的K⁺/Na⁺比。转AtNHX1-TsVP基因棉花在温室NaCl溶液培养下表现出较高的光合效率。在正常条件下（无NaCl）生长,转AtNHX1-TsVP基因棉花的净光合速率（P_n）与WT相比差异不显著。随着NaCl浓度的增加,所有棉花株系中的P_n均降低,转基因株系的降幅小于WT。125 mmol·L^-1和250 mmol·L^-1NaCl分别胁迫14 d,AT1、AT2、AT3的P_n分别比WT高22.48%、32.53%、34.451%和19.87%、29.96%、32.85%。气孔导度（Gs）的变化趋势与P_n相同,随着NaCl浓度的增加Gs降低,但转基因株系的降幅较低。125 mmol·L^-1和250 mmol·L^-1NaC分别胁迫14 d,AT1、AT2、AT3的Gs分别比WT高15.31%、17.44%、20.81%和48.05%、58.18%、63.92%。在正常条件下（无NaCl）生长时,转TsVP-AtNHX1基因株系与WT的光系统II最大量子产额F_v/F_m（the maximum PSⅡquantum vield）均在0.835⁰.837,无显著差别。125 mmol·L^-1和250 mmol·Z^-1NaCl分别胁迫14 d,转基因株系AT1、AT2、AT3的F_v/F_m分别提高2.71%、3.11%、2.97%和4.05%、6.46%、7.44%。推测在温室盐胁迫条件下叶片气孔导度下调和光系统Ⅱ的活性受到抑制导致棉花净光合速率的降低。3个转AtNHX1-TsVP基因棉花株系和WT种植于东营河口区盐碱地中(2015年,土壤含盐量为3.71 g·kg^-1;土壤中Na⁺含量为0.82 g·kg^-1),AT1、AT2、AT3的F_v/F_M在0.792⁰.806,显著高于WT（0.757）。转基因株系的净光合速率（P₂）比WT提高23.59%³5.25%,气孔导度比WT高14.87%²1.59%。结果表明,转基因株系在遭受盐胁迫后PSII受损较轻,共表达AtNHX1和TsVP基因显著增强了盐胁迫下棉花叶片的光合作用能力,推测这是盐碱田中转基因株系具有更高籽棉产量的生理学基础。因此,过表达AtNHX1-TsVP基因棉花在盐碱地中具有更高的出苗率、成苗率和籽棉产量。过表达AtNHX1-TsVP的转基因棉花在盐胁迫下的生长表现可能与植株中更多的Na⁺、K⁺和Ca²⁺积累相关,这些阳离子的积累有利于棉花细胞在盐胁迫下的维持离子的稳态和渗透势,从而维持较高的叶片相对含水量更高的光合效率。转AtNHX1-TsVP基因棉花具有提高盐碱地中棉花产量的潜力,可应用于提高我国盐溃田的籽棉产量。更多还原