弓形虫效应分子GRA15Ⅱ诱导巨噬细胞极化抗小鼠肝癌的研究

【作者】 李源玲； 蔡亦红； Faustina Poppoe； 沈继龙；

【机构】 安徽病原生物学省级实验室,人兽共患病安徽省重点实验室(安徽医科大学),安徽医科大学病原生物学教研室； 安徽医科大学公共卫生学院检验教研室；

【摘要】 目的:探讨弓形虫效应分子GRA15_Ⅱ诱导的caMφ逆转小鼠肝癌微环境中的TAMs从M2向M1极化,抑制肿瘤增殖、侵袭及转移,旨在为肿瘤免疫治疗提供新思路和新策略。方法:从Ⅱ型弓形虫PRU株中提取总RNA,扩增多态性GRA15_Ⅱ编码基因,构建重组质粒pegfp-gra15Ⅱ。体外将质粒亚克隆入慢病毒载体并感染小鼠细胞系RAW264.7,使之诱导为ca Mφ。体外分别将Lv-gra15Ⅱ-Mφ（A组）,空白病毒载体Lv-Mφ（B组）和未感染Mφ（C组）与小鼠肝癌细胞系Hepa1-6进行transwell共培养,观察上述三组Hepa1-6的增殖、迁移和侵袭能力,以及MMP-9和MMP-2表达。体内实验,取75只SPF级4-5w龄雌性C57/BL6小鼠,右腹股沟皮下成瘤。3d后随机分为3组,每组25只。A组为在皮下注射成瘤后3d、5d分别尾静脉给予重悬于150μl生理盐水的2×106 Lv-gra15Ⅱ-Mφ;B组给予重悬于150μl生理盐水的2×106 Lv-Mφ;C组给予150μl生理盐水。在皮下注射成瘤10d后无痛处死小鼠。剥离肿瘤组织,观察实体瘤体积;免疫组化检测肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）浸润和免疫抑制因子及血管生成相关因子的表达;瘤体q RT-PCR检测iN OS、TGF-β、VEGF、IL-6和IL-10表达;ELISA检测IL-6水平的变化。结果:1.GRA15_Ⅱ可驱动RAW264.7向ca Mφ方向极化。FCM、细胞培养上清和q RT-PCR检测均显示Lv-gra15Ⅱ-Mφ相比于Lv-Mφ和Mφ,其PD-L1,CD80,NO、TNF-α,IL-12p40和iN OS有显著升高（P<0.05）。2.体外共培养实验显示,Lv-gra15Ⅱ-Mφ可抑制小鼠肝癌细胞Hepa1-6迁移、侵袭,可下调其外基质相关蛋白的分泌,而对Hepa1-6凋亡无影响。q RT-PCR和蛋白水平检测均显示A组与B组和C组比较,MMP-9、MMP-2表达显著下调（P<0.05）。3.体内试验TAMs检测结果,Lv-gra15Ⅱ-Mφ可减轻TAMs浸润,并且使其向M1方向偏移,抑制肿瘤的增生。实体瘤免疫组化分析显示,A组TAMs浸润显著减少（P<0.05）,IL-10,TGF-β及血管内皮生长因子（VEGF）表达下调,而MHC Ⅱ增加。q RT-PCR检测显示A组实体瘤中iN OS表达明显增加（P<0.05）,而TGF-β、VEGF、IL-6和IL-10表达抑制。ELISA检测显示A组瘤体内的IL-6分泌下调（P<0.05）。结论:弓形虫效应分子GRA15_Ⅱ慢病毒感染RAW264.7,可驱动后者向caMφ极化,且GRA15_Ⅱ在宿主细胞内可稳定、持续表达。在肿瘤发生早期被动输入虫源性GRA15_Ⅱ驱动的ca Mφ可通过调节TAMs的浸润和偏移明显抑制肿瘤在体内的进展。GRA15_Ⅱ对宿主无明显毒副作用,具有深入研究的应用价值。更多还原