实时荧光定量TaqMan探针法早期诊断日本血吸虫感染方法学的建立

【作者】 董盼盼； 杨俊齐；

【机构】 卫生部寄生虫病预防与控制重点实验室江苏省寄生虫病分子生物学重点实验室江苏省血吸虫病防治研究所；

【摘要】 目的:本研究拟通过筛选日本血吸虫的保守性好、重复度高的特异性基因,建立实时荧光定量Taq Man探针法早期诊断日本血吸虫感染的方法学。方法:通过查找大量文献,确定日本血吸虫基因组DNA中的4个多拷贝序列:18S小亚基单位核糖体核酸基因(18SrR NA)序列(序列号:AY157226.1)、Sjrh1.0(序列号:U92488.1)、逆转录转座子SjR 2的G55A序列(G55A)(序列号:AF412221.1)和线粒体基因NADH-Ⅰ(序列号:AF215860),设计SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR引物及Taq Man探针法引物、探针。以日本血吸虫成虫、阳性钉螺、病人血清的基因组DNA为模板进行检测,以弓形虫和肺吸虫及病人感染血清作对照。结果:所选四个特异性基因在以日本血吸虫成虫、阳性钉螺、病人血清的基因组DNA为模板进行检测时,均分别出现特异性扩增,琼脂糖电泳无杂带;而对照组中均出现非特异性扩增,琼脂糖电泳有杂带。且Taq Man探针法的敏感性可达到10fg,特异性亦高于SYBR GreenⅠ染料法,3h内完成,感染后检测到阳性结果时间缩短到1周。结论:运用实时荧光定量Taq Man探针法检测日本血吸虫感染阳性钉螺及病人,早期、快速、灵敏、特异性高。更多还原