甜瓜无毛基因gl的图位克隆与转录组分析

【作者】 朱华玉； 孙小粉； 宋芃垚； 胡建斌； 杨路明；

【机构】 河南农业大学园艺学院；

【摘要】 目前关于甜瓜无毛性状的研究仅停留在其遗传规律分析和生理特性,尚未进行相关基因的克隆与分子机制的研究。本研究中通过图位克隆的方法在甜瓜上分离到1个控制无毛性状的候选基因gl,它编码一个HD-ZIPⅣ转录因子。结果不仅对甜瓜性状改良和育种有重要的理论和实践意义,而且有助于丰富和完善对多细胞类型表皮毛形成分子机制的认识。选用甜瓜正常材料M465,植株茎蔓及叶片表面有刚毛和短茸毛,用手触摸较粗糙有扎手感;无毛材料M68茎蔓表面、叶柄、叶片及子房上均无刚毛和茸毛,用手触摸非常光滑。通过构建F2群体,利用分离群体分析法（BSA）在初步定位的基础上,通过对亲本的重测序在候选区段开发SSR、SNP和InDel等标记,进一步利用F₂群体对gl基因进行精细定位,然后对候选区段的基因预测和序列比较,最终克隆到控制甜瓜无毛性状的候选基因gl。此外,采取了BSR-seq（Bulked Segregate RNA-seq）的方法进行转录组分析,对无毛基因的定位结果进行验证及揭示甜瓜控制表皮毛形成的的调控网络。利用M465和M68两个材料作为亲本,构建了1个含有1 536株的F₂群体,遗传分析表明甜瓜无毛性状是由一对隐性单基因控制,并将其命名为gl,然后选用480对SSR标记利用BSA法对两个亲本和混池进行筛选,将gl基因初步定位在8号染色体上,并选择256个F₂单株作为初步作图群体进行了初步定位。在此基础上,对亲本M465和M68进行重测序,在候选区域开发6个InDel标记,并利用1 536株的F₂群体进行精细定位,最终将gl基因定位在InDel2和InDel5之间1 1.58 kb的范围内,对该区段进行ORF预测发现只有一候选基因,该基因DNA全长5 367 bp,CDS全长2 166bp,编码1个含有721个氨基酸的蛋白,经BLAST比对显示它与黄瓜上已经克隆的无毛基因Csa6M514870同源性高达99%,均编码HD-ZIPⅣ蛋白。与正常材料序列相比,该基因在无毛材料中发生10个SNP位点突变,其中有4个位于外显子上,6个位于内含子上,且位于第4个外显子上发生SNP导致gl基因在突变体中转录翻译提前终止。根据其中1个外显子的SNP开发成dCAPS标记,在甜瓜573份种质材料中进行了基因型分析,结果与表型调查结果一致,进一步验证了HD-ZIPⅣ就是控制甜瓜表皮毛的候选基因。此外,根据两个BSR-seq混池之间的SNP差异进行的ED关联结果显示,该候选基因的定位区域位于1.98到3.72 Mb范围内,而通过图位克隆的方法将gl基因定位于甜瓜8号染色体上2.45 Mb左右的位置,两种定位方法结果一致。更多还原