樱桃根癌病病原菌鉴定及抗病樱桃砧木的初步筛选

【作者】 倪杨； 段续伟； 张晓明； 闫国华； 王晶； 周宇； 张开春；

【机构】 北京市林业果树科学研究院农业部都市农业(华北)重点实验室；

【摘要】 明确樱桃根癌病的病原以及筛选抗病种质资源,是有效预防樱桃根癌病的前提与基础。2016年,在北京市林业果树科学研究院樱桃资源圃内,选择发病严重的樱桃砧木‘CAB’为冠瘿瘤采集对象,切取根系上的幼嫩瘤体,采用常规组织分离法进行病原菌的分离和纯化,经革兰氏染色鉴定后,对获得的菌株按柯赫氏法则在向日葵和‘彩虹’樱桃实生苗上进行致病性验证,并对致病菌株进行生理生化检测以及16S rDNA序列分析,明确樱桃根癌病病原菌的种类。利用该病原菌,配置浓度为OD₆₀₀=0.6的新鲜菌悬液,采用新梢针刺注射法对7种常见樱桃砧木（‘CAB’、‘colt’、‘G5’、‘对樱’、‘兰丁1号’、‘兰丁2号’、‘京春1号’）的2年生盆栽扦插苗进行人工接种,2个月后统计冠瘿瘤直径,计算病情指数并对樱桃砧木的抗病性进行评价。从樱桃砧木‘CAB’冠瘿瘤中分离、纯化出7株革兰氏阴性细菌,菌落均为圆形突起,灰白色至乳白色,半透明,表面光滑,有粘性。将其针刺注射接种在向日葵茎部以及‘彩虹’樱桃实生苗的茎部,编号为RWF02和RWF06的菌株能够产生冠瘿瘤,并能够被重新分离出来。用27F/1492R通用引物对两株菌株的16S rDNA进行扩增并测序,同源性比对结果显示RWF02和RWF06分别与根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）（序列号HQ143621.1）和葡萄土壤杆菌（A.vitis）（序列号NR 113735.1）同源性最高,均为99%,结合生理生化指标鉴定RWF02菌株为原生物Ⅰ型菌种,RWF06菌株为原生物Ⅲ在型菌种,因此确定该根癌病是由根癌土壤杆菌（A.tumefaciens）原生物Ⅰ型和葡萄土壤杆菌（A vitis）原生物Ⅲ型两种病原菌引起的复合侵染。利用分离得到的野生型葡萄土壤杆菌A.vitis按种7种常见砧木,两个月后仅‘CAB’接种部位形成典型的冠瘿瘤,发病率为100%,并且病原菌能够从冠瘿瘤中再次分离,其他樱桃砧木材料均不发病。用野生型根癌土壤杆菌（A.tumefaciens）接种后,7种樱桃砧木表现出不同程度的抗病性,病情指数为6.67%⁸6.5%,按照抗性分级标准进行评价:‘京春1号’为高抗,‘兰丁2号’为抗病,‘对樱’、‘兰丁1号’和‘G5’为中抗,‘CAB’为感病,‘colt’为高感。本试验首次发现,葡萄土壤杆菌（A.vitis）和根癌土壤杆菌（A.tumefaciens）两种病原菌复合侵染樱桃砧木‘CAB’,且在7种常见樱桃砧木中,葡萄土壤杆菌只侵染‘CAB’,该鉴定结果将为今后樱桃根癌病的生物防治和抗病育种工作提供重要参考。更多还原