【作者】 张艳娇； 李长育； 魏玮； 王锦辉； 刘春燕； 辛大伟； 陈庆山；

【Author】 ZHANG Yan-jiao;LI Chang-yu;WEI Wei;WANG Jin-hui;LIU Chun-yan;XIN Da-wei;CHEN Qing-shan;College of Agriculture,Northeast Agricultural University;

【机构】 东北农业大学农学院大豆遗传改良实验室；

【摘要】 大豆在生长过程中对氮的需求很高。大豆同根瘤菌共生形成根瘤,进而进行固氮反应。而Ⅲ型效应因子由根瘤菌的Ⅲ型泌出系统分泌,是影响根瘤菌与豆科植物建立共生关系的关键信号分子。Ⅲ型泌出系统或Ⅲ型效应因子突变后,根瘤菌在宿主植物上的结瘤特性会发生改变,但是不同的Ⅲ型效应因子是如何影响结瘤的,目前还没有相关突破性研究成果的报告。本研究主要针对根瘤菌HH103的Ⅲ型效应因子NopB与NopL展开研究。通过突变验证Ⅲ型效应因子NopB和NopL对共生结瘤的影响,并筛选其与大豆中互作的蛋白。主要结果如下:首先,对根瘤菌HH103的Ⅲ型效应因子NopB、NopL的编码序列进行克隆,并完成插入突变,即在起始密码子ATG下游20bp以内插入编码卡纳霉素抗性基因的序列,并保证突变位点的上下游有500~800bp的序列。将序列连入pQ200SK载体,采用三亲杂交的方法获得突变体HH103ΩnopB、HH103ΩnopL。并用Southern杂交验证突变体。最后将突变体在绥农14、野生豆和全基因组导入系的4份大豆材料上进行结瘤鉴定,结瘤实验结果显示nopB、nopL突变后根瘤菌在上述大豆品种上的结瘤数目比野生型明显减少,其中Ⅲ型效应因子NopB突变后结瘤数目减少幅度远大于NopL突变体,这表明在根瘤菌与大豆建立共生关系的过程中NopB起关键作用。其次,为了进一步验证Ⅲ型效应因子NopB、NopL对共生结瘤的影响,我们用电击的方法将表达载体转入相应突变体,获得回补菌株。经PCR验证后,将回补菌株再次进行结瘤鉴定,结果显示Ⅲ型效应因子得到回补后根瘤菌的结瘤能力得到了恢复。回补菌株的结瘤实验再次验证了Ⅲ型效应因子NopB、NopL对共生结瘤起关键作用,突变以后能抑制根瘤菌在大豆上的结瘤。最后,为了研究NopB在宿主植物中的作用,将NopB编码序列构建到PGADT7和PGBKT7载体,采用酵母双杂交技术以寻找大豆中与NopB互作的功能蛋白。经过筛选找到一个与NopB存在互作的植物宿主蛋白NopBIP,该蛋白与细胞壁结构和植物的抗性有关。更多还原