斑马鱼活性转座子(ZB)的发现及其活性验证研究

【作者】 沈丹； 薛松磊； 钱跃； 王赛赛； 陈才； 史云强； 高波； 王宵燕； 崔恒宓； 宋成义；

【机构】 扬州大学表观遗传学和表观基因组学研究所,扬州大学动物科学与技术学院；

【摘要】 由于活性转座子在基因组内具有可以移动的特性,因此在转基因和基因治疗等领域具有很好的应用前景,目前PB、SB、Tol2等转座子已经作为基因治疗和转基因的重要介导载体进行广泛应用,并取得显著进展。本研究通过生物信息学分析,在斑马鱼基因组中发现存在5个完整的Te1/Mariner家族DNA转座子。遗传分化比较表明,其中1个转座子活性最强,是年轻转座子,命名为ZB。完整ZB转座子全长1.4kb,两端各有一个对称的203bp的末端反向重复序列,中间含有1026bp的转座酶基因编码序列。将ZB转座子的203bp的末端反向重复序列和1026bp的转座酶编码序列克隆并构建成转座子框架载体pZB-Msc和转座酶辅助质粒。转座酶辅助质粒包括两种形式,一种是pCMV-ZB真核表达质粒,包括病毒启动子序列(CMV)和ZB转座酶cDNA序列和SV40多聚腺苷酸(PolyA),能自主表达转座酶;另一种是pZB-mRNA体外转录辅助质粒,包括Sp6、T7启动子、ZB转座酶cDNA序列和T7转录终止序列(terminator),可以进行体外转录形成5’加帽ZB转座酶的mRNA。将含有新霉素性基因表达盒、含有鸡beta-act-in启动子和GFP基因的绿色荧光蛋白表达盒、含有鲤鱼beta-act-in启动子和GFP基因的绿色荧光蛋白表达盒分别克隆至转座子框架载体pZB-Msc,形成转座子供体质粒pZB-PGK-NEO、pZB-CAG-GFP和pZB-FAG-GFP,然后分别在哺乳动物细胞、小鼠胚胎和斑马鱼胚胎上验证其转座活性。将转座子供体质粒pZB-PGK-NEO和转座酶辅助质粒pCMV-ZB,以1:1质量比混合,经多聚阳离子PEI包裹,共转染小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),转染48h后用终浓度为500μg·mL-1的G418进行耐药性筛选,至正常细胞全部死亡。吉姆萨染色观察并计数,试验结果表明实验组表达新霉素抗性基因的细胞数量显著高于对照组(P<0.05)。将转座子供体质粒pZB-CAG-GFP和转座酶pCMV-ZB/ZB-.mRNA混合注射为实验组,单转座子质粒注射为对照组,注射后4-5d至胚胎发育至囊胚期观察,试验结果显示3组胚胎均有荧光,同等培养条件下,加转座酶质粒组、转座酶mRNA组和未加转座酶组的胚胎阳性率分别为31.76%(n=3)、33.43%(n=3)和4.34%(n=3),加转座酶组的胚胎阳性率均显著高于未加转座酶组(P<0.05),加转座酶组的胚胎阳性率之间差异不显著(P>0.05)。同样将转座子供体质粒pZB-FAG-GFP和ZB转座酶mRNA以不同浓度(10、30、50、100ng/μL)混合注射为实验组,单质粒注射为对照组,分别显微注射斑马鱼一细胞期胚胎,于注射后24hpf和5dpf观察GFP表达情况,结果显示添加转座酶各组的阳性率显著高于对照组(P<0.05),转座酶浓度为50ng/μL时,注射后24hpf和5dpf的阳性率最高。本研究表明,新发现的ZB转座子是活性转座子,该转座子能够在哺乳动物细胞、小鼠胚胎和斑马鱼胚胎上高效介导外源基因转移,在转基因动物制备和基因治疗中具有较好的应用前景。更多还原