虾夷扇贝硫氧还蛋白基因克隆及原核表达

【作者】 鲍相渤； 赫崇波； 张振宇； 李云峰； 高磊； 高祥刚； 苏浩； 刘卫东；

【机构】 辽宁省海洋水产科学研究院辽宁省海洋水产分子生物学重点实验室； 辽宁省大连工业大学食品学院；

【摘要】 硫氧还蛋白系统是广泛存在于生物体的还原酶系统,在氧化还原调节和抗氧化防御中起重要作用,并参与调节细胞增殖和生存过程。作为该系统的重要组分,硫氧还蛋白能够维持一些酶类正常的氧化还原状态,且具有调节转录因子的活性。本研究根据构建虾夷扇贝肾脏组织EST文库获得的序列,克隆出两条硫氧还蛋白基因序列(MyTrx1a,MyTrx1b)并进行了序列分析、相对转录量测定和原核表达分析。结果表明,两条硫氧还蛋白cDNA全长序列分别为1508bp、1336bp,其中MyTrx1a编码104个氨基酸,MyTrx编码106个氨基酸,均具有严格保守的-C-G-P-C-功能域。MyTrx1a相对转录量最高的组织为肾脏,MyTrx1b则在闭壳肌中转录量最高,相同组织中MyTrx1a的mRNA相对转录量大于MyTrx1b。在虾夷扇贝受精卵至担轮幼虫期间的不同发育阶段中,MyTrx1b的相对转录量变化幅度大于MyTrx1a;鳗弧菌对血淋巴中Trx转录水平影响的检测中,两种Trx转录量分别于12小时和24小时开始显著上调,MyTrx1b变化幅度大于MyTrx1a。对两条Trx序列进行了原核表达载体构建,在大肠杆菌中表达,并对融合蛋白进行了纯化,采用胰岛素还原法对重组Trx进行了活性鉴定。结果显示,成功构建了两个pET30a-Trx重组质粒,纯化的目的蛋白浓度分别为0.47mg/mL和0.23mg/mL,重组Trx具有催化DTT还原胰岛素的活性,MyTrx1a的特异还原活性更强。更多还原