microRNA-483在人体细胞中生物学功能的研究

【作者】 袁君婷； 刘洋洋； 韩笑； 崔恒宓；

【机构】 扬州大学表观遗传学和表观基因组学研究所； 扬州大学生物科学与技术学院；

【摘要】 microRNA(miRNA)是长约20-25个核苷酸并具有调控功能的非编码RNA。研究表明miRNA参与生命活动中多种调控途径包括表观遗传学调控、细胞周期调控和细胞分化调控等。miRNA-483是一种在多种真核生物中存在的micorRNA。相关研究表明,miRNA-483有促癌作用,其中一个靶基因为抑癌基因。本研究旨在使用CRISPR/Cas9系统对HEK293细胞和肠癌细胞HCT116中的miRNA-483敲除和过表达,研究其生物学功能。首先设计特异性识别miRNA-483的两个核苷酸序列,分别连到含有Cas9和CRISPR基座的载体骨架中,命名为miRNA-knockout-1和miRNA-knockout-2。载体中分别携带EGFP荧光蛋白基因及Puro~r抗性基因。为确保有效的同源重组,选取了miRNA-483两边800bp作为左右同源臂。敲除的同源重组载体命名为miRNA-knockout-donor。为构建miRNA过表达载体,选取人基因组中AAVS1基因作为靶向序列,用同样的方法构建miRNA-483过表达的同源重组载体miRNA-overexpression-donor和CRISPR/Cas系统的载体miRNA-overexpression-1和miRNA-overexpression-2。与敲除载体不同的是,miRNA-overexpression-donor中含有miRNA-483的序列。分别将这些载体转染到HEK293细胞和肠癌细胞HCT116中。使用荧光或者抗生素进行筛选,然后提取各组细胞的DNA和RNA,用PCR测序检测基因组中是否敲除和插入miRNA-483序列,用实时荧光定量证实miRNA-483的表达情况。同时观察miR-483敲除和过表达对细胞形态及生长速度的影响。更多还原