紫竹梅PAP1基因的克隆分析及其遗传转化烟草研究

【作者】 段真珍； 徐志伟； 张凯； 姚伟；

【机构】 广西大学农学院； 三峡大学生物技术研究中心；

【摘要】 紫竹梅(Setcreaseapurpurea Boom)又名紫鸭趾草,原产美洲墨西哥,为鸭趾草科多年生的常绿草本植物,其叶片常年为紫色,是一种四季皆可观赏的优良花卉品种。紫竹梅的叶片中含有丰富的花青素和原花色素,其中花青素是水溶性类黄酮类的天然色素。花青素主要存在于植物表皮细胞的液泡中,使得植物的花、果实、种皮呈现出红色、蓝色和紫色。在植物生长发育中花青素具有多种重要的生理功能,它可以吸引昆虫的传粉,防止植物受到紫外辐射,从而保护植物DNA免受破坏、保证细胞分裂分化等生命活动正常进行,同时还可以抵御低温和抵抗植物病害等。另外,国内外大量临床试验研究表明,花青素具有抗氧化、延缓衰老、预防心脑血管疾病、保护肝脏、抑制肿瘤细胞发生等多种生理功效。因此,开展花青素合成代谢途径及其调控机制的研究,对于提高可食性植物中花青素含量和改良观赏性植物的花色具有重要意义。植物中花青素的合成主要受花青素合成结构基因和调节基因的调控。调节基因编码的转录因子可以调控结构基因的时空表达。转录因子通过对目的基因在转录水平上的表达调控,在植物生长发育和代谢过程中发挥着重要的调节作用。其中MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,它广泛参与植物的花青素合成,细胞的分化与发育,信号转导以及抗逆抗病等次生代谢的调控。本研究通过同源基因克隆的方法,根据其它物种中基因的同源保守序列设计特异性引物,以紫竹梅叶片mRNA为模板,利用RT-PCR从紫竹梅中扩增获得了全长MYB转录因子PAP1的基因,命名为spPAP1。该克隆的cDNA全长为750bp,经Omega2.0软件分析,该cDNA序列包含有一个完整的开放读码框,编码249个氨基酸。蛋白质特征预测和蛋白序列结构分析发现紫竹梅的PAP1具有MYB转录因子家族特有的R1R2保守序列。为实现花青素在烟草中的积累,研究花青素对烟叶品质改良的应用潜力,将克隆的spPAP1基因插入pCAMBIA0380载体,构建了植物表达载体pC0380-spPAP1,并在农杆菌介导下利用叶盘法转化烟草受体材料,在含有100mg/L的卡那霉素的MS+2.0 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA分化培养基上筛选获得紫红色抗性幼芽,并在生根培养基MS+0.1 mg/L NAA上再生出烟草植株。组织化学检测结果显示,转基因烟草植株叶片呈现特异的蓝色反应,表明GUS基因在烟草中成功实现了特异表达。分子生物学水平的检测也证明PAP1基因在烟草中成功整合和转录,实现PAP1基因在烟草中的异源过量表达,获得可大量积累花青素的紫色改良烟草。本项目研究成功克隆了紫竹梅转录因子spPAP2基因并在烟草中进行了功能验证,为利用生物技术手段开发高花青素含量和高抗氧化性食品,以满足人们日益增长的对功能性健康食品的需求奠定了技术基础,具有重要的现实意义和经济价值。更多还原