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狂犬病毒G抗体新型红细胞凝集试验检测方法的建立

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【作者】 周松峰廖文军白安斌覃绍敏袁书智袁洁林俊赵武吴健敏

【机构】 广西兽医研究所广西南宁惠朋动物药业有限责任公司广东省农业科学院动物卫生研究所

【摘要】 目的疫苗免疫是有效控制狂犬病传播的重要手段,本研究建立一种简便、快速、直观、可现场操作的定量检测狂犬病毒G抗体的新型红细胞凝集试验方法,为农村等基层单位开展狂犬病监测及疫苗免疫效果评估提供一种简便、快速、可现场操作的检测方法。材料与方法采用重叠延伸(SOE)PCR方法将抗人红细胞H抗原单链抗体基因(2E8ScFv)和狂犬病毒G基因主要抗原表位区(KG基因)拼接成融合基因2E8KG,进而构建原核表达质粒pET-Trx-2E8KG。通过原核表达、纯化、复性获得既能够与人不同血型红细胞结合,又能够与狂犬病毒(RV)高免血清反应的双功能融合蛋白。以此双功能融合蛋白为检测抗原,以人"O"型红细胞作为指示细胞,建立了快速检测狂犬病毒G抗体的方法。结果与讨论本研究借助表面抗原背景清楚的人红细胞作为指示剂,以非凝集型抗人红细胞表面H抗原单链抗体为桥梁,通过检测抗原的桥联作用结合人红细胞,产生肉眼可见的凝集,以一种全新的视角建立动物病原微生物快速检测技术。通过方阵滴定试验筛选出检测抗原最佳稀释度为1:16,对应的工作浓度为106.26μg/mL,血清最佳稀释度为1:16,作用时间30min。利用该方法检测犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)阳性血清均无凝集,与RV标准阳性血清反应出现强凝集,表明该方法特异性强。用不同批次制备的检测抗原重复检测狂犬病毒阳、阴性血清,检测结果具有很好的重复性。将新型红细胞凝集试验与荧光抗体病毒中和试验(FAVNT)作平行比对,通过对临床1225份犬血清的检测,结果发现血凝价大于或等于1:16(相当于FAVNT试验中和效价0.5IU/mL)为免疫抗体合格;新型红细胞凝集试验检测结果与FAVNT方法一致性分析的Kappa值为0.78>0.75,检测结果的符合率为88.82%,灵敏度和特异度分别为96.13%、81.32%。从检测结果看本检测技术在特异性方面仍需努力,估计与检测抗原提纯度不够有关,应在下一步制备工艺方面进一步努力,获取纯度更好的检测抗原。此外,在检测结果判断时间仍较长,我们拟进行检测抗原的可溶性表达以提高诊断抗原的生物活性,提高快速检测的时间。结论初步建立了基于2E8Kg双功能融合蛋白为检测抗原的检测狂犬病病毒G抗体的新型红细胞凝集试验,为基层单位(尤其是农村散养犬)开展狂犬病免疫效果评估提供了一种简便、快速、敏感、特异、仅凭肉眼就可以判断结果的检测方法。

  • 【会议录名称】 中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会论文集
  • 【会议名称】中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会
  • 【会议时间】2015-09-03
  • 【会议地点】中国山东济南
  • 【分类号】S852.4
  • 【主办单位】中国畜牧兽医学会动物传染病学分会、解放军军事医学科学院军事兽医研究所
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