宿主细胞内的小G蛋白Rab1通过与布菌效应蛋白DnaK结合调节布菌在细胞内的早期生长

【作者】 魏盼； 王琳； 孙长江； 崔桂梅； 孙万春； 彭其胜；

【机构】 吉林大学人兽共患病研究所人兽共患病教育部重点实验室；

【摘要】 引言布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)被列为我国法定传染病中的乙类传染病之首,是由布鲁氏菌(Brucella)侵入机体后引起的传染-变态反应性人兽共患细菌病。布鲁氏菌是典型的胞内生存菌,可以在细胞内生存和增殖,这是其致病的关键原因。虽然国内外进行了许多布鲁氏菌胞内生存机制方面的研究,但是有关布鲁氏菌如何利用其Ⅳ分泌系统分泌的效应蛋白寄生宿主细胞,目前尚不清楚。本研究尝试以宿主细胞小G蛋白Rab1为靶蛋白,筛选出与Rab1互作的Ⅳ型分泌系统分泌的效应蛋白,研究其在调节布鲁氏菌胞内生长中的作用。材料与方法(1)构建GST-Rab1、GST-Rab1(S25N)、GST-Rab1(Q70L)融合蛋白,SDS-PAGE,银染,质谱分析。(2)免疫共沉淀、Western blotting、激光共聚焦及Ⅳ分泌系统分泌验证实验。(3)布菌(B.abortus strain 2308)感染宿主细胞后CFU检测及用慢病毒感染构建Rab1沉默稳转细胞系。结论(1)通过将宿主细胞内的Rab1基因沉默或在宿主细胞内过表达Rab1(S25N)、Rab1、Rab1(Q70L)证明宿主细胞Rab1蛋白促进布菌在胞内的生长。(2)通过GST pull-down实验,分析差异蛋白,然后对其进行质谱分析,鉴定出该差异蛋白为DnaK,(3)共转染DnaK和Rab1于293T细胞,通过免疫共沉淀实验,确定布菌热休克蛋白DnaK与宿主细胞Rab1蛋白特异结合。(4)通过激光共聚焦及Ⅳ分泌系统分泌实验即构建DnaK-CyaA融合蛋白检测宿主细胞内cAMP变化,证明DnaK蛋白为Ⅳ分泌系统分泌的效应蛋白。(5)通过感染布菌后检测细胞内布菌数(即CFU实验)证明宿主细胞Rab1蛋白通过募集布菌热休克蛋白DnaK至布鲁氏菌菌泡(BCV,Brucella-Containing Vacuole)调节布菌在细胞内的早期生长。更多还原