副猪嗜血杆菌双向电泳方法的建立

【作者】 王晨燕； 方勤美； 王隆柏； 车勇良； 刘玉涛； 周伦江；

【机构】 福建省农业科学院畜牧兽医研究所； 福建省农业科学院生物技术研究所；

【摘要】 前言近年来,临床上从患病猪的病理脏器中分离出副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)的比例越来越高,给我国养猪业带来严重的危害。为建立副猪嗜血杆菌蛋白质组学双向电泳方法,本试验通过超声-裂解(7M尿素裂解液)-离心法提取全蛋白,样品采取主动水化上样,经一向等电聚焦、二向SDS-PAGE和凝胶染色后最终获得副猪嗜血杆菌双向电泳图谱。HPS双向电泳体系的建立,为进一步开展副猪嗜血杆菌的蛋白质组学研究奠定了基础。材料和方法(1)材料:副猪嗜血杆菌临床分离株由本科室于2012年在南平猪场分离并保存。Immobiline DryStrip(pH4-7),DTT,硫脲,CHAPS,DeStreak reagent,碘乙酰胺,2D-clean up试剂盒均购自GE公司。(2)方法:通过超声-裂解-离心法提取全蛋白,BCA法测定蛋白浓度,一向等电聚焦采用11cm胶条,主动水化上样,配置12.5%凝胶进行二向凝胶电泳,电泳结束后采用银染法进行染色,具体操作步骤参考GE双向电泳操作指南进行。将电泳凝胶用ImageScannerⅢ扫描仪拍照,然后用分析软件PDQuest 8.0进行分析。结果与讨论通过超声-裂解-离心法提取HPS全蛋白,用BCA法测定副猪嗜血杆菌其蛋白浓度为7.69mg/mL。样品在SDS-PAGE凝胶上条带主要分布在25kDa-100kDa之间,主要条带的分子量大致为100kDa、85kDa、78kDa、58kDa、50kDa、40kDa和27kDa。其中相对分子量40kDa、50kDa、58kDa的蛋白为高丰度蛋白。蛋白样品采用11cm胶条,上样量为200μg,经双向电泳获得的HPS电泳图谱聚焦效果较好,背景较清晰,可以检测到194蛋白点,但是蛋白点数量偏少,双向电泳条件有待优化。目前,蛋白质组学在生命科学研究领域已得到广泛应用,双向电泳技术作为蛋白质组学研究的三大核心技术之一,仍然是目前分析复杂样品中蛋白质的分辨率最高的工具,它可以在一块凝胶上分辨出1,000多个蛋白质点,适用于平行分析大量的蛋白质系统。它的基本原理是先根据蛋白质等电点的不同进行一向等电聚焦,然后根据蛋白质分子量大小在SDS-PAGE胶上分离,最后采用高灵敏度的染色方法使蛋白点呈现在胶上。本研究中建立的副猪嗜血杆菌双向电泳方法还需要进一步优化,提高凝胶分辨率,分离得到更多的蛋白点,为今后进一步开展HPS的比较蛋白质组学和免疫蛋白质组学研究奠定基础。更多还原