猪流行性腹泻病毒E和M基因的遗传变异分析

【作者】 王隆柏； 周伦江； 刘玉涛； 车勇良； 吴学敏； 陈如敬；

【机构】 福建省农业科学院畜牧兽医研究所；

【摘要】 前言猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起猪的一种接触性肠道传染病,各种年龄的猪均能感染发病,临床症状主要表现为腹泻、呕吐和脱水,其中以哺乳仔猪感染后的危害最为严重,病死率可高达100%。为了解流行PEDV毒株的变异情况,本研究室前期开展了PEDV的S、N和ORF3基因的变异分析,结果发现流行毒株的这3个基因片段确实存在不同程度的变异。那么对于PEDV毒株相对稳定的E和M基因,是否也出现基因变异?为此,本研究通过对2012-2014年的19份PEDV阳性病料进行了E和M基因序列测定,并分析了基因的变异情况。材料和方法(1)材料:采集2012-2014年PEDV检测为阳性规模猪场的病料,并从中选出具有代表性的19株毒株进行研究。病毒DNA/RNA提取试剂盒购置TANGEN公司,PCR扩增试剂盒购置北京全式金生物科技有限公司,其他反应试剂购自大连宝生生物工程有限公司。(1)方法:设计合成了2对扩增E基因和M基因片段的引物,通过核酸提取及RT-PCR反应,回收PCR产物连接于PMD18-T载体中,转入到DH5α菌株,重组质粒经1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,阳性质粒送至生工生物工程(上海)有限公司进行序列测定。利用DNAMAN软件将所测定的E基因、M基因与参考毒株进行序列比对,分析其同源性,构建遗传进化树。结果与讨论根据测序结果与CV777标准毒株相比较,2012-2014年收集的19株PEDV的E基因除了13株毒株存1个氨基酸突变外,未发现其他氨基酸突变、缺失和插入现象。18株PEDVM基因序列发生若干个氨基酸突变,未发现其他氨基酸的缺失和插入。19株PEDV E基因的核苷酸之间的同源性为97.4%~100.0%,与attenuated DR13弱毒株和CV777标准株同源性分别为97.4%~100.0%和97.0%~99.6%。18株PEDV M基因的核苷酸之间的同源性为97.4%~100.0%,与attenuated DR13弱毒株和CV777标准株同源性分别为97.2%~99.6%和97.5%~98.4%。核苷酸遗传进化树表明福建流行PEDV毒株的E基因与标准CV777毒株亲缘关系较近,而M基因与2008年泰国流行的KU05CB08毒株亲缘关系较近,是个新的基因型,可能源于泰国。登录GenBank 37个基因序列,这进一步丰富了PEDV的分子流行病学数据,更为今后研制PED的新型诊断试剂和疫苗提供理论依据。更多还原