羊外周淋巴细胞酵母双杂交文库构建

【作者】 秦鸽鸽； 关贵全； 刘军龙； 刘爱红； 谢俊仁； 牛庆丽； 陈泽； 殷宏； 罗建勋； 李有全；

【机构】 家畜疫病病原生物学国家重点实验室； 农业部草食动物疫病重点实验室； 甘肃省动物寄生虫病重点实验室； 中国农业科学院兰州兽医研究所；

【摘要】 羊泰勒虫病(ovine and caprine theileriosis)是由蜱传播的寄生于绵羊和山羊巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内的泰勒科泰勒属的原虫所引起疾病的总称。该病在我国大部分地区都有分布,但在我国北方地区危害最为严重,主要呈地方性流行,能引起绵羊和山羊的大批死亡,因而给养羊业造成重大的经济损失。已报道我国的羊的泰勒虫有3个种,尤氏泰勒虫(Theileria uilenbergi)、吕氏泰勒虫(T.luwenshuni)和绵羊泰勒虫(T.ovis)。其中尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫致病力最强,绵羊泰勒虫致病力很弱或没有致病性。T1SP是吕氏泰勒虫的一种表面膜蛋白。有研究表明,T1SP是吕氏泰勒虫在子孢子、裂殖体及裂殖子三个阶段均有表达,其重组蛋白不仅与吕氏泰勒虫阳性血清发生反应,还与环形泰勒虫、尤氏泰勒虫及绵羊泰勒虫等的阳性血清也能发生反应。据报道,T1SP蛋白具有较强的免疫原性和抗原保护性。因此,对此蛋白的深入研究具有重要意义。本实验通过研究吕氏泰勒虫裂殖体与羊淋巴细胞之间的相互作用,来研究T1SP蛋白在泰勒虫入侵宿主过程中的作用。实验以羊外周淋巴细胞为材料,构建羊淋巴细胞酵母双杂交的cDNA文库。首先,以密度梯度离心分离出未感染泰勒虫羊淋巴细胞,提取总RNA,经反转录合成单链cDNA,通过LD-PCR合成ds cDNA。层析柱剔除250 bp以下的小片段cDNA;将双链cDNA与文库质粒pGADT7-Rec一起转入到酵母Y187感受态细胞内,双链cDNA与文库质粒通过同源重组形成重组质粒,通过抗性筛选即可得到酵母双杂交cDNA文库。对文库进行评定,文库滴度达1.088×10~8 CFU,细胞密度为1.075×10~9 cell/ml,并随机挑取36个文库菌落进行PCR,核酸电泳显示插入片段长度在250~3000 bp之间,重组率为92%,达到酵母双杂交调取相互作用蛋白的要求。更多还原