牛泰勒虫病通用血清学诊断方法的建立

【作者】 赵帅阳； 李有全； 刘爱红； 刘军龙； 马米玲； 赵洪喜； 杨聪山； 殷宏； 关贵全； 罗建勋；

【机构】 中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,甘肃省动物寄生虫病重点实验室；

【摘要】 牛泰勒虫病是由泰勒虫属的原虫寄生于牛的网状内皮细胞和红细胞内所引起的蜱传性血液原虫病,以发热、贫血、黄疸及体表淋巴结肿大为典型特征,呈全球性分布,其中小泰勒虫和环形泰勒虫是致病性最强的两种病原。在我国,已报道的有环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫三种病原。环形泰勒虫的媒介蜱为残缘璃眼蜱、小亚璃眼蜱和盾糙璃眼蜱,瑟氏泰勒虫的媒介蜱主要是长角血蜱,中华泰勒虫的媒介蜱为青海血蜱。本研究以主要梨浆虫表面膜蛋白(Maior Piroplasm Surface Protein,MPSP)为研究对象,以原核表达系统对环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒的MPSP分别进行表达纯化,其中瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫重组蛋白从上清中用镍柱纯化得到,浓度分别0.2 mg/ml和0.28mg/ml,环形泰勒虫来自于包涵体,蛋白经变性和复性后,溶度为0.2 mg/ml;这3种重组蛋白的反应原性和特异性实验表明,这3种泰勒虫的重组蛋白均能与其他两种牛泰勒虫阳性血清反应,但与牛巴贝斯虫、大巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和羊的巴贝斯虫、吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫以及羊无形体阳性血清没有交叉反应,从而表现出泰勒虫属特异性;以3种重组抗原,在同一抗原浓度浓度及反应条件下进行间接ELISA反应,发现它们与Western Blot结果一致,考虑到蛋白活性,浓度以及反应原性等因素,最后选择中华泰勒虫MPSP重组蛋白为抗原建立了牛泰勒虫病的通用ELISA诊断方法并进行相关条件的优化,最终确定抗原、血清及二抗稀释倍数为1:100、1:200和1:40000,封闭液为2%BSA,并用MedCalc对47份PCR检测为阴性的血清和67阳性血清OD值的ROC曲线进行分析,从而确定该ELISA方法的阈值为30.33%,敏感性和特异性分别为100%和95.7%;最后建立的间接ELISA方法对我国陕西、青海、新疆、西藏、甘肃、河北、河南、辽宁、吉林和内蒙古10个省份的1936血清进行了检测,抗体阳性率在23.1%-67.3%之间,并结合媒介蜱的自然地理分布情况,对这些地区牛泰勒虫病的流行情况进行了讨论,为我国牛泰勒虫的防治提供了相关信息和技术支持。更多还原