牛环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫多重PCR检测方法的建立及应用

【作者】 刘军龙； 李有全； 刘爱红； 关贵全； 谢俊仁； 殷宏； 罗建勋；

【机构】 家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室中国农业科学院兰州兽医研究所； 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心；

【摘要】 泰勒虫病是引起牛的一类重要疾病,主要病原包括环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫/东方泰勒虫和小泰勒虫等。其中,环形泰勒虫是引起热带泰勒虫病的主要病原,广泛分布在北非、欧洲南部、印度、中东和亚洲。在日本和韩国,瑟氏泰勒虫是引起放牧牛和水牛的一种主要血液原虫。环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫在我国均有分布。研究表明,环形泰勒虫致病性较强,而瑟氏泰勒虫分布范围较广。在野外感染情况下,两种泰勒虫经常发生混合感染,由于形态非常相似,传统显微镜检测不能很好把两种泰勒虫完全区分。为能够更好的检测区分两种泰勒虫,本研究中建立了一种鉴别诊断两种泰勒虫的多重PCR方法。通过序列比对,设计了针对环形泰勒虫cytochrom B（COB）和瑟氏泰勒虫转录间隔区（ITS）的特异性引物。通过实验验证,两对引物能够在一个PCR反应体系中分别扩增出环形泰勒虫（393bp）和瑟氏泰勒虫（818bp）的基因片段。将实验室中储存的两种泰勒虫标准株DNA进行10倍比稀释(10ng/μ1-10^-8ng/μl),用稀释后的DNA对引物的敏感性进行了测试。在多重PCR条件下,环形泰勒虫引物可检测到10^-7ng/μl的虫体DNA,瑟氏泰勒虫引物能够检测到10^-6ng/μl的虫体DNA。两对引物的敏感性均高于已报道的PCR方法。特异性检测试验证实,两对引物只能够特异性的扩增相对应的泰勒虫基因,与国内报道的其它泰勒虫和巴贝斯虫无交叉反应。为验证该方法的应用性,我们将建立的多重PCR方法和已发表的针对环形泰勒虫COB基因和瑟氏泰勒虫的MPSP基因的PCR方法对国内8各省市的378份牛血液样品分别进行了检测,并将检测结果进行了比对。多重PCR方法检测出环形泰勒虫感染11例,瑟氏泰勒虫感染81例,混合感染3例,其它两种方法分别检测出环形泰勒虫感染6例,瑟氏泰勒虫感染80例,混合感染1例。通过野外样品检测证实,环形泰勒虫在广东省、内蒙古、吉林省和重庆市存在,瑟氏泰勒虫在检测的8个省市均有分布。研究结果显示本研究中建立的多重PCR方法具有较高的敏感性和特异性,与已发表的PCR方法检测效率相似,可以应用于环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫的流行病学调查。更多还原