糖基噻唑啉衍生物的合成与活性研究

【作者】 沈生强； 孔涵楚； 许一仁； 杨青； 王道全； 张建军；

【机构】 中国农业大学理学院应化系； 大连理工大学生命科学与技术学院；

【摘要】 害虫为害是制约农业生产持续稳定发展的重要因素之一,是直接影响农业、农村发展和农民增收的重要限制因素。研究这些农业害虫的生理特征可以发现,其生长发育过程与几丁质的代谢密切相关。因此,深入对几丁质代谢相关过程的研究可以有效地推动农作物病虫害的防治进程。几丁质代谢是一个极复杂的过程,需要激素和酶在时空上的精准平衡,又可分为几丁质的合成代谢、几丁质的水解代谢。几丁质的合成代谢包括一系列复杂的胞内、胞外生化和生理的转化,而其中许多生理过程尚不明了;包括几丁质合酶在转录和翻译水平上的激素调节及翻译后加工过程、几丁质合酶簇到细胞中正确位点的指导和运输过程、几丁质的跨膜转运及定向过程等;此外,几丁质合成酶抑制剂如酰基脲类的确切作用机制也不明确。而几丁质的水解过程就相对简单,而且研究地较为透彻;在几丁质水解过程中,几丁质先由18家族几丁质内切酶和19家族壳二糖酶水解为几丁寡糖,再由20家族β-N-乙酰己糖胺酶水解为β-N-乙酰己糖胺单元。针对几丁质降解过程的相关酶是近年来新农药靶标的研究热点。目前,针对18家族、19家族的几丁质酶抑制剂报道较少,大多为天然产物,合成难度较大,且选择性较低;而针对20家族β-N-乙酰己糖胺酶为靶标的抑制剂种类较多,这些抑制剂分子可以分为以下几大类:PUGNAc、NGT、Nagstatin、PMG-chitotriomycin、DNJNAc等,都表现出很强的酶抑制活性,相关化合物衍生的报道也有很多;但是在这些化合物中,含有糖基噻唑啉结构的化合物NGT是唯一依据水解过渡态设计的酶抑制剂分子,在酶催化反应中,一个很重要的特点是底物的反应过渡态与酶的亲和力,远远大于底物或产物与酶的亲和力,因而底物的过渡态与酶具有更加强的结合能力。因此,课题组根据NGT母体结构并结合酶的活性口袋特征合理设计出了如下结构的化合物(图),并研究了其酶抑制活性以及杀虫活性。在合成NMT化合物过程中,以N-乙酰氨基甘露糖为原料,通过全乙酰化、选择性脱1位乙酰基、劳森试剂关环、脱乙酰基得到目标化合物。在合成NNMT系列化合物的过程中,以氨基甘露糖盐酸盐为原料,通过与2-羟基萘甲醛反应生成希夫碱、全乙酰化保护羟基、希夫碱脱除得到2-氨基-1,3,4,6-四-O-乙酰基甘露糖草酸盐;再与硫光气反应生成异硫氰酸酯,进而和一系列取代胺反应生成硫脲,并在氢溴酸条件下关环得到全乙酰化的糖基噻唑啉,最后脱除乙酰基得到目标化合物NNMT。利用上述合成方法合成2个系列共计10个NGT衍生物,目标化合物经过核磁共振波谱,高分辨质谱的得到确证。在得到目标化合物后,我们测试了其对20家族β-N-乙酰己糖胺酶以及84家族hOGA酶的抑制活性。选择对硝基苯基2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNP-β-GlcNAc)为荧光底物,采用终点测定法,利用酶水解糖苷键后生成的游离对硝基苯酚在405nm的特征吸收来测定酶的活性;具体方法为将一定量的酶液和缓冲溶液(Britton-Robinson buffer,pH值=6.0)混合均匀后,再加入0.2mmol/L的pNP-β-GlcNAc和一定浓度的测试药液,控制终体积为100μl,并于30℃的条件下温育30min,加入100μl的0.5mol/L的碳酸钠溶液终止反应,于405nm处测定荧光吸收值。酶活性测试表明,部分抑制剂在25μmol/L浓度下表现出较好的酶抑制活性。参照化工行业提供的《农药生物活性测定标准操作规范(SOP)》要求,对所设计合成的化合物进行典型试虫的杀虫活性进行普筛试验,测试了对小菜蛾和棉铃虫的活体杀虫活性,具体方法为在600mg/kg浓度下通过浸渍法处理叶片,3天后测定虫体死亡率,杀虫活性表明,多数化合物对小菜蛾具有较高的杀虫活性,部分化合物活性高于对照药氟铃脲。更多还原