PCR扩增模板量对组织CpG岛甲基化检出有重要影响

【作者】 刘兆君； 周静； 邓大君；

【机构】 北京市肿瘤防治研究所暨北京大学临床肿瘤学院病因室；

【摘要】 目的:研究DNA模板量对CpG岛甲基化检出结果的影响。方法:以福尔马林固定石蜡包埋胃组织(n=268)和冷冻新鲜胃组织(n=376)DNA为对象,用内参基因COL2A1的荧光定量PCR测定Ct值(与含量呈反比)代表DNA模板量;用甲基化特异性荧光定量PCR(MethyLight)检测代表性基因GFRα1和ZNF382的CpG岛甲基化状态。用GFRα1和ZNF382甲基化的RKO细胞和未甲基化的GES1细胞的亚硫酸氢钠修饰DNA为标准品,倍比稀释法确定最小DNA模板需要量。结果:(1)代表性基因GFRα1和ZNF382 CpG岛甲基化检出阳性样品的DNA模板量明显高于甲基化阴性样品(P<0.001):GFRA1甲基化检出阳性和阴性冷冻组织的COL2A1 Ct中位数值分别为29.6和32.0,石蜡组织分别为31.0和32.9;ZNF382甲基化检出阳性和阴性冷冻组织分别为29.6和31.8,石蜡组织分别为3 1.8和35.3。这些提示模板量对甲基化检出结果可能有重要影响;(2)确定最低DNA模板需要量:用TE缓冲液稀释RKO细胞DNA,只有每管15μl PCR反应液中RKO细胞DNA模板量≥0.13ng时,甲基化GFRAl信号才能够被稳定检出;用GES1细胞DNA稀释RKO细胞DNA 64倍(1.54%)后,只有当每管15μl PCR反应体系的COL2A1的Ct值<29.3(总DNA模板量>8.5ng)时,甲基化GFRA1信号才能够被稳定检出;(3)通过增加模板量可避免假阴性甲基化检出:对第一次测定时内参基因Ct值>29.3的94份石蜡组织样品增加模板量再分析,使得内参基因Ct<29.3,GFRA1甲基化阳性率由原来的10.6%增加到39.4%(P<0.001),ZNF382甲基化阳性率由74.5%增加到96.8%(P<0.001);增加内参基因Ct值>29.3的94份冷冻组织模板量亦可观察到类似结果:GFRA1的甲基化阳性率由72.3%增加到95.7%(P<0.001);甲基化检出阳性和阴性样品的内参基因Ct值不再存在差别。结论:DNA模板量对CpG岛甲基化的PCR检测结果有重要影响,确定模板的最低需要量对避免假阴性结果出现至关重要。更多还原