肝细胞癌中HBx上调DNMT1抑制了RIZ1基因表达

【作者】 宋伟； 劳英斌； 仇雪梅； 乔凤昌； 公丕海； 张丽华； 陆森； 樊红；

【机构】 "发育与疾病相关基因"教育部重点实验室东南大学； 东南大学医学院； 南京医科大学附属第一医院；

【摘要】 目的:肝细胞癌是世界范围内严重危害人类生命和健康的疾病,在我国发病率和死亡率均较高,其中HBV感染是我国肝细胞癌主要的病因之一。HBV编码的蛋白中,乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)被认为是参与慢性乙型肝炎病理过程和诱发肝癌的最重要的蛋白质,但是其诱发肝细胞癌发生的具体分子机制尚不十分清楚。RIZ1基因属于组蛋白甲基转移酶家族,是新近证实的肿瘤相关抑癌基因。RIZ1在多种原发性肿瘤中均存在低表达的现象,且低表达与其上游启动子区高频率的甲基化有关。RIZ1在肝癌中的低表达与HBV的感染具有一定相关性,但具体机制尚不清楚。本课题探讨在与HBV感染相关肝细胞癌中RIZ1异常表达的机制及其与HBV感染的关系。方法:1.构建HBV关键基因HBx和对照组空质粒表达载体,建立HBx转染肝细胞永生化细胞及肝癌细胞模型,并检测RIZ1的表达。2.Msp法检测HBx转染的细胞系中RIZ1启动子区DNA甲基化状态。3.DNA甲基转移酶抑制剂5’-Aza处理HBx表达的细胞系MHCC-97H,检测RIZ1的表达情况。4.染色质免疫共沉淀技术检测DNMT1蛋白是否与RIZ1启动子区结合。5.芯片筛选对DNMT1调控的microRNA。6.免疫组化及qRT-PCR技术在肝癌临床病例中检测RIZ1的表达。7.肝正常永生化细胞系L02、癌旁、癌细胞系及表达HBx的97H和HepG2.215细胞系中检测RIZ1的mRNA及蛋白表达情况。结果:1.HBx的表达载体稳定转染下调了RIZ1的表达。2.HBx增加了RIZ1的甲基化水平,上调DNMT1的表达。3.DNA甲基转移酶抑制剂5’-Aza处理后恢复了RIZ1的表达,RIZ1启动子区DNA甲基化也发生改变。4.染色质免疫共沉淀技术检测到DNMT1蛋白与RIZ1启动子区结合,这种结合在转染HBx后进一步加强。5.转染HBx后可下调miR-152,miR-152的转染抑制了DNMT1的表达。6.在肝癌临床病例中RIZ1低表达,而且RIZ1的低表达与HBV感染相关,HBx对抑癌基因RIZ1表达有抑制作用。7.细胞系中检测RIZ1的mRNA及蛋白表达,肝癌细胞系中RIZ1表达相对正常和癌旁细胞下调,并且在表达HBx的97H和HepG2.215细胞系中表达更低。结论:HBx抑制了RIZ1的表达,这一过程是通过HBx下调miR-152进而增强DNMT1表达,最终导致RIZ1启动子区高甲基化的表遗传调节机制来沉默其表达的。更多还原