管内固相微萃取-MALDI联用技术用于磷酸肽富集检测研究

【作者】 王思雨； 王琳； 汪夏燕； 郭广生；

【机构】 北京工业大学环境与能源工程学院化学化工系；

【摘要】 蛋白质和肽的磷酸化调控着几乎所有的细胞学过程,包括信号传递、基因表达、新陈代谢等。哺乳动物细胞体内约三分之一以上的蛋白质可以被磷酸化,异常的磷酸化过程将会引起严重的疾病[1],如:癌症、中风、阿尔兹海默症状等[2]。对蛋白质和肽中磷酸化位点进行全面的分析将有助于了解疾病形成的原因,为研究靶向治疗药物提供帮助。然而,在生物体中,可逆的磷酸化过程是动态不稳定的。在质谱分析中,磷酸化肽的信号往往被非磷酸化肽的信号所抑制。因此,磷酸化蛋白和肽的富集对提高磷酸化位点的检测具有重要的意义。由于二氧化钛(Ti O2)化学性质稳定、萃取选择性高成为富集磷酸肽最常用的方法。特别是纳米Ti O2具有很高的萃取容量。而作为萃取相制备纳米Ti O2填充柱时,柱塞的制备过程十分困难且不能有效封堵纳米粒子,限制了在复杂蛋白中的应用。本研究提出采用紫外原位聚合制备柱塞的方法制备多孔纳米二氧化钛填充柱,用于管内固相微萃取(In-tube-SPME)技术富集磷酸肽。以原位聚合的整体柱段作为柱塞,保障了较高的机械强度及化学稳定性;以高比表面积的多孔纳米Ti O2颗粒作为萃取相进行填充,显著增加活性面积、提高萃取容量,使得有效长度较短的填充柱仍具有良好的萃取效果。应用此萃取柱对单磷酸肽和四磷酸肽的混合物(v:v=1:1)进行富集,并以MALDI进行检测,得到的萃取前后分析结果对比图如图1所示。经萃取后,单磷酸肽和四磷酸肽的相对峰强度均大于90%。我们进一步将萃取柱应用于α-casein、β-casein及BSA酶解混合溶液中磷酸肽的分析,实验结果显示经纳米Ti O2填充柱萃取后能够有效的提高磷酸肽的检测灵敏度。本研究设计制备了对磷酸肽具有强萃取效果的填充柱,在对复杂蛋白酶解液中磷酸肽的高效富集方面具有一定的应用前景。更多还原