马兜铃酸-Ⅰ致小鼠胚胎干细胞衍生肝组织成瘤性评价研究

【作者】 李彤； 李璐； 苏锟楷； 王一帆； 毛峥嵘； 赵彼得； 虞浩； 朱丹雁； 项春生； 楼宜嘉；

【机构】 浙江大学药学院药理毒理研究所； 浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室； 浙江大学竺可桢学院巴德年班大学生科研训练计划项目(SRTP)； 浙江大学医学院基础医学系病理学与病理生理学研究室；

【摘要】 【目的】采用基于前期实验结果建立的小鼠胚胎干(ES)细胞衍生肝组织炎癌转化评价实验新体系,探索其是否适用于体内成瘤性评价研究。【方法】ES细胞衍生肝组织采用经典的悬滴培养法,贴壁培养当天(D 5+0)开始持续加入一定浓度的人类致癌剂马兜铃酸-Ⅰ(AAI),肝组织分化成熟(D 5+18)时消化成单细胞悬液,以一定的密度注入裸鼠背部皮下,每隔一天观察肿瘤生长及裸鼠健康状况;待肿瘤生长满足如下条件之一即将肿瘤取出制备石蜡切片,HE染色考察肿瘤的组成结构,免疫荧光考察相关标志物的表达情况:1裸鼠濒死,表现为体重明显减轻、活动明显迟缓等;2.肿瘤出现淤血、破皮、结痂、坏死等;3.荷瘤体积大于1 cm~3,且大小相对均一。【结果】溶剂对照(DMSO)组与实验(AAI)组衍生肝组织细胞悬液注入裸鼠背部皮下,均能形成肿瘤,成瘤时间及肿瘤体积无显著性差异。HE染色结果显示,DMSO组肿瘤内细胞类型杂乱无章,呈现明显的畸胎瘤三胚层结构;而AAI组肿瘤内部结构较单一,偶见畸胎瘤结构,大部分细胞呈核大深染的肿瘤细胞特征,提示AAI组肿瘤很可能是来源于同一种细胞的均质瘤。免疫荧光结果显示,在白蛋白(Albumin,ALB)阳染区域内,DMSO组肿瘤未见与甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)、胆管标志物细胞角蛋白7(Cytokeratin 7,CK7)、细胞角蛋白19(Cytokeratin 19,CK19)共染的细胞;而AAI组肿瘤出现ALB分别与AFP、CK7、CK19共染的细胞,共染阳性率分别为37.50%,54.17%和50.00%,提示DMSO组肿瘤内的肝细胞均已成熟,其肿瘤很有可能是衍生肝组织中未分化完全的干细胞形成;而AAI组个别肿瘤内的肝细胞较幼稚,呈肿瘤祖/干细胞表型,这些细胞很可能是形成该组肿瘤的源细胞(AAI组其他肿瘤来源待鉴定)。【结论】AAI致小鼠ES细胞衍生肝组织炎癌转化体外评价实验体系所获阳性结果,与进一步在体内成瘤性评价结果相吻;为研究肝脏炎癌转化新的分子事件及药物毒性筛选提供了新型实验体系。更多还原