Nrf-2/ARE通路在纳米SiO₂致人永生化表皮细胞氧化损伤中的作用

【作者】 陶功华； 肖萍； 洪新宇； 郑卫东； 娄丹； 孙静秋； 王彦琴； 仲伟鉴； 帅怡；

【机构】 上海市疾病预防控制中心毒性评价科；

【摘要】 【目的】探讨Nrf-2/ARE信号转导通路在纳米二氧化硅（nano-SiO₂）致人永生化表皮细胞氧化应激损伤中的作用。【方法】采用RNA干扰技术构建人永生化表皮细胞（HaCaT）Nrf-2基因缺陷细胞株（HaCaT-SiRNA-Nrf2）,以终浓度为2.5、5.0和10.0μg/ml的nano-SiO₂（15nm粒径）分别处理HaCaT和HaCaT-SiRNA-Nrf2细胞24h,MTT法检测细胞活力改变,同时采用ELISA和细胞免疫荧光技术对各浓度组细胞内活性氧（ROS）、8-羟化脱氧鸟苷（8-oHdG）、丙二醛（MDA）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等氧化应激相关指标进行测定。采用实时荧光定量PCR检测Nrf-2基因的表达改变,同时采用Western Blotting检测Nrf-2/ARE通路中相关蛋白的表达变化。【结果】与正常HaCaT细胞相比,HaCaT-SiRNA-Nrf2细胞内Nrf-2蛋白和mRNA水平均显著降低,其中mRNA水平降低了90.1%。5.0和10.0μg/ml nano-SiO₂可引起HaCaT细胞的活力显著降低（P<0.05）,而2.5μg/ml nano-SiO₂即可引起HaCaT-SiRNA-Nrf2细胞活力呈剂量依赖性显著降低,各浓度组HaCaT-SiRNA-Nrf2细胞的活力均显著低于同浓度组的HaCaT细胞（p<0.05）。与正常HaCaT细胞相比,HaCaT-SiRNA-Nrf2细胞内T-SOD和GSH-Px含量显著降低（p<0.05）。各处理组细胞内ROS、8-oHdG和MDA水平均呈剂量依赖性增高,而T-SOD和GSH-Px含量呈剂量依赖性降低,与同浓度组HaCaT细胞相比,HaCaT-SiRNA-Nrf2细胞内相关指标的变化程度更大,差异有统计学意义（p<0.05）。随着nano-SiO₂暴露浓度的增高,两组细胞中总Nrf-2蛋白和mRNA表达水平均呈先增高后降低的趋势,2.5和5.0μg/ml组细胞核内Nrf-2蛋白表达水平显著增高。Nrf-2基因缺陷可使细胞中HO-1、SOD和GST等蛋白的表达水平出现不同程度的降低,其中SOD和GST蛋白表达显著性降低（p<0.05）;经nano-SiO₂处理后,HO-1、SOD和GST的表达水平均呈先增高后降低的趋势,与未处理组细胞相比,2.5和5.0μg/ml组细胞中HO-1和SOD蛋白表达水平显著增高（p<0.05）,而10.0μg/ml组细胞中多数下游蛋白的表达水平已低于未处理对照组细胞。【结论】15nm粒径的SiO₂可诱导人永生化表皮细胞发生氧化应激性损伤,Nrf-2基因沉默可通过改变细胞的抗氧化防御能力,显著增加细胞对nano-SiO₂的敏感性,而Nrf-2基因的激活、核转位及其对下游ARE相关蛋白的调控在调节细胞内氧化-抗氧化体系中起重要作用。更多还原