miR-98及其宿主基因Huwe1调控纳米二氧化硅所致的小鼠精母细胞凋亡

【作者】 徐菠； 冒志磊； 嵇晓丽； 姚梦梦； 陈敏健； 王心如； 夏彦恺；

【机构】 南京医科大学公共卫生学院卫生毒理系现代毒理学教育部重点实验室生殖医学国家重点实验室毒理研究所；

【摘要】 【目的】研究miR-98及其宿主基因Huwel在纳米二氧化硅所致的小鼠雄性生殖细胞凋亡中的作用。【方法】用纳米粒度仪检测纳米二氧化硅在培养基中的表征(Zeta电位及水合粒径);透射电镜观察纳米二氧化硅在两种雄性生殖细胞系中的分布和定位;检测不同浓度纳米二氧化硅染毒两种小鼠雄性生殖细胞系(小鼠精母细胞和小鼠睾丸支持细胞)后的细胞活力;流式细胞仪检测纳米二氧化硅染毒两种雄性生殖细胞系的细胞周期、细胞凋亡;高内涵分析系统检测纳米二氧化硅染毒两种细胞系后的多参数细胞毒性;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹实验(Western blot)检测凋亡相关因子的改变;通过多种软件TargetScan(http://www.targetscan.org),miRanda(http://www.cbio.mskcc.org/mirnaviewer),PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)和RNA22(http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html)预测调控凋亡基因的miRNA及其宿主基因。构建质粒,通过转染实验和双荧光素酶报告基因实验验证miRNA对基因的直接调控。【结果】纳米二氧化硅在培养基中的水合粒径为161±2 nm,Zeta电位为-9±1 mV,透射电镜结果显示纳米二氧化硅颗粒定位在细胞的溶酶体内,细胞核内没有发现,不影响细胞核膜的完整性;纳米二氧化硅(100μg/mL)不影响细胞活力;纳米二氧化硅(100μg/mL)引起小鼠精母细胞凋亡;高内涵分析系统结果显示纳米二氧化硅(100μg/mL)会引起小鼠精母细胞膜通透性增加、线粒体膜电势下降,但不影响细胞色素C的含量;RT-PCR和Western blot结果显示纳米二氧化硅(100μg/mL)染毒小鼠精母细胞后,凋亡相关因子(Bax,Caspase-3 and Caspase-9)显著增加,Bcl-2显著下降。纳米二氧化硅(100μg/mL)染毒小鼠精母细胞后,调控Caspase-3的miR-98显著下降,miR-98的宿主基因Huwel显著下降。Pearson相关分析显示miR-98与Caspase-3成负相关(R~2=0.7809,p<0.001),miR-98与Huwel成正相关(R~2=0.3838,p<0.001);转染miR-98 mimics后,Caspase-3的mRNA和蛋白水平显著下降;共转染miR-98 mimics和pGL3-Caspase-3-miR-98-WT质粒后,双荧光素酶报告基因结果显示miR-98直接调控Caspase-3的表达。【结论】纳米二氧化硅颗粒会引起小鼠精母细胞系的细胞膜通透性升高,线粒体膜电势下降,Caspases的激活。此外,我们发现miR-98可以直接调控Caspase-3的表达,miR-98及其宿主基因Huwel可以调控纳米二氧化硅所致的小鼠精母细胞凋亡。更多还原