MiRNA在介导顺铂致SH-SY5Y神经细胞毒性损伤中的作用

【作者】 陈雄； 张莹莹； 刘万红； 何小华；

【机构】 武汉大学基础医学院病理学与病理生理学系； 贵州医学大学环境污染与疾病监控省部共建教育部重点实验室；

【摘要】 【目的】研究miRNA在介导顺铂对SH-SY5Y神经细胞毒性中的作用及其可能的分子机制。【材料和方法】向SH-SY5Y细胞中加入一定浓度梯度的顺铂并作用24小时,用MTT法测定顺铂对SH-SY5Y细胞的半数抑制浓度(IC₅₀);顺铂IC₅₀作用于SH-SY5Y细胞,用流式细胞术检测顺铂对SH-SY5Y细胞周期及凋亡的影响;用Westernblot检测细胞周期蛋白D1（Cyclin D1,CCND1）和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved PARP及Cleaved caspase-3的表达变化;用Real-time PCR检测芯片结果中提示的顺铂所致miRNA的表达变化;根据Real-time PCR结果选择差异性较大的miRNA,分别促进和抑制其表达并联合使用顺铂,观察它们对顺铂毒性的调控作用。【结果】顺铂显示出对SH-SY5Y细胞的毒性作用,细胞活力随着顺铂浓度的增加而逐渐降低;将顺铂IC₅₀分别作用于SH-SY5Y细胞24小时,48小时和72小时,流式结果提示顺铂在作用48小时和72小时可以使其细胞周期阻滞在G1期（p<0.01）,并诱导其凋亡（p<0.01）,且72小时凋亡率高于48小时凋亡率（p<0.05）;Western blot结果显示CCND1和Bcl-2的表达随时间的增加而减少,Bax、Cleaved PARP及Cleavedcaspase-3的表达随时间的增加而增加;Real-time PCR结果表明,顺铂IC₅₀在48小时和72小时均可以明显促进miR-128,miR-139,miR-323和miR-503的表达（p<0.01）并抑制miR-10b和miR-21的表达（p<0.01）;用化学合成的miRNA模拟物促进外源性miR-139和miR-503的表达,可以有效抑制CCND1和Bcl-2的蛋白水平（p<0.01）,增加Bax、Cleaved PARP及Cleaved caspase-3的表达并增加顺铂对SH-SY5Y细胞的凋亡作用（p<0.05）;用化学合成的miRNAinhibitor抑制内源性miR-139和miR-503的表达,可以提高CCND1和Bcl-2的蛋白水平,降低Bax、Cleaved PARP及Cleaved caspase-3的表达并减弱顺铂对SH-SY5Y细胞的凋亡作用（p<0.05）;荧光素酶报告基因检测结果显示miR-139和miR-503均可以抑制CCND1和Bcl-2 3’UTR的活性（p<0.05）。【结论】miR-139和miR-503可能通过靶向调控CCND1和Bcl-2 3’UTR并抑制其表达,介导了顺铂所致SH-SY5Y神经细胞的毒性损伤。更多还原